卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于宫颈癌，死亡率占各类妇科肿瘤的首位，严重威胁着女性的身体健康和生命安全。手术及化疗可治愈大多数卵巢癌初期患者，但临床上出现耐药的患者日益增多，晚期患者死亡率依然很高。故寻找有效的抗卵巢癌的药物成为热点课题之一^[1]。

随着植物化学技术的进步，传统医药的化学成分及功效逐渐被发现。黑种草Nigella damascene L. 主要分布于我国新疆及中东、中亚等地中海沿岸国家，全草均可入药，其种子含油高达30%。近年研究表明黑种草籽具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖、调血脂、保肝等多种药理活性^[2]。百里醌是黑种草籽油中分离得到的主要有效物质，具有清除羟自由基和活性氧自由基的能力，以及强大的抗肿瘤效应，可抑制多种恶性肿瘤细胞生长和转移^{[3, 4, 5]}。但其抗肿瘤机制尚未完全明确。本实验观察百里醌体内外对卵巢癌生长的影响，并探讨其作用机制，为百里醌应用于临床治疗卵巢癌提供实验基础。

百里醌，批号H47007，质量分数99%，购自美国Sigma公司，以无水乙醇配制成2 mg/mL母液，临用时RPMI1640培养基稀释成所需浓度；凋亡ELISA、CCK-8、活性氧（ROS）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；胎牛血清、RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；Nrf2、Keap1、Akt、p-Akt、NQO1、GCLC抗体购自美国Sigma公司；胞浆蛋白、磷酸化蛋白提取试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

雌性BALB/c裸鼠，8～10周龄，体质量18～20 g，购于中国科学院上海实验动物中心。动物合格证号SCXK（沪）2007-0005。

人卵巢癌细胞株SKOV3购自中国科学院上海细胞库，培养在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，37 ℃、5% CO₂培养箱下培养。细胞单层贴壁生长，至70%～80%融合时胰蛋白酶消化传代。

收集处于对数生长期的SKOV3细胞，制成单细胞悬液，接种到96孔板，每孔5×10³个，过夜贴壁后，分组如下：对照组，加入等量的1%乙醇溶液；百里醌15、30、60、120 μmol/L组，加入相应浓度的百里醌；每组3孔。设置空白孔，不加细胞加入等量的PBS。置37℃培养箱24 h，药物作用结束前1 h，各孔加入CCK-8溶液0.01mL，继续培养1 h，使用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度（A）值，计算细胞存活率［存活率＝(给药组A值－空白孔A值)/(对照组A值－空白孔A值)］。

实验分为2组：对照组，加入等量的1%乙醇溶液；百里醌组，加入60 μmol/L百里醌。药物作用24 h，细胞凋亡检测按照试剂盒说明书进行。

细胞分组及药物处理同“2.2”项，收集各组细胞，1 000 r/min离心5 min，得细胞沉淀，避光条件下加入适当体积稀释好的2,7-二氢二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA），细胞培养箱内孵育20 min，培养液漂洗3次，荧光酶标仪测定荧光强度。

细胞分组及药物处理同“2.2”项，收集各组细胞，加入含PMSF的细胞裂解液，提取上清液为细胞总蛋白。按试剂盒说明书提取胞浆蛋白及磷酸化蛋白。测量蛋白浓度后取等量蛋白样品上样，10% SDS-PAGE电泳，半干转膜仪转膜，5%脱脂奶粉封闭后加入一抗Nrf2、Keap1、Akt、p-Akt、NQO1、GCLC，4 ℃过夜，再度洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h，ECL显色，X线胶片曝光，用软件Quantity One分析条带灰度值。

软件Primer3设计特异性引物，序列见表 1。Trizol法提取总RNA，取2 μL测定260、280 nm处A值，A₂₆₀/A₂₈₀值为1.8～2.0，说明RNA纯度较高。应用实时荧光定量PCR（RT-PCR）试剂盒进行逆转录和PCR。反应条件：95 ℃、1 min，60 ℃、1 min，65 ℃、2 min，循环40次。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，以GAPDH作为内参，Bio-Rad Gel凝胶图像分析系统扫描，分析目的基因相对表达水平。

表 1(Table 1)

表 1 NQO1、GCLC引物序列 Table 1 Primer sequences of NQO1 and GCLC 引物名称 正向引物 (5’-3’) 反向引物 (5’-3’) NQO1 AGCCGTCATTTGTAAGTCCTG AATGCTTGATGATCTACTCTTC GCLC AGGCCGATAATGAGGACTGGG CGACCTTATTCCACTTTGTACCT GAPDH ACCAGCAAGCACAACCACGAG TTCGTCAATACAACCATGATGA

表 1 NQO1、GCLC引物序列 Table 1 Primer sequences of NQO1 and GCLC

将2×10⁶个SKOV3细胞悬浮于0.2 mL培养基中，注射到裸鼠腋下皮肤内建立卵巢癌皮下移植瘤模型。接种2周后，选择移植瘤直径约为10 mm的裸鼠，随机分为对照组和百里醌组，每组8只（保证每组至少5只成功完成实验）。对照组ig 1%无水乙醇0.2 mL；百里醌组，ig给药剂量为20 mg/kg（根据预试验结果确定），每2天给药1次，给药2周；第8周处死裸鼠，仔细剥离皮下移植瘤组织并称质量，计算抑瘤率。

取新鲜移植瘤组织，经10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，脱蜡水化后，按照免疫组化试剂盒操作步骤进行染色，在高倍镜下随机选择20个视野，计算镜下阳性细胞所占比例。

实验结果均以(x± s )表示。应用SPSS16.0软件，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。

SKOV3细胞经浓度为15、30、60、120 μmol/L的百里醌作用24 h后，细胞存活率分别为（85.2±4.4）%、（75.1±3.5）%、（54.1±2.0）%和（34.1±2.7）%（n＝3），与对照组比较，差异均显著（P＜0.05、0.01）。百里醌作用24 h后IC₅₀为61.4 μmol/L，因此选择60 μmol/L进行后续实验。

60 μmol/L百里醌作用SKOV3细胞24 h后，诱导细胞凋亡率为（13.7±1.1）%（n＝5），与对照组凋亡率（3.8±0.6）%比较，差异显著（P＜0.01）。

SKOV3细胞经百里醌作用24 h后，细胞内DCF密度值为（68.3±2.7，n＝5），与对照组（54.9±4.4）比较，差异显著（P＜0.05）。

与对照组比较，百里醌组胞核Nrf2蛋白、胞浆p-Akt蛋白表达率显著下调（P＜0.05）；Akt蛋白表达无显著差异（P＞0.05）；Keap1蛋白表达显著上调（P＜0.001）。结果见图 1。

与对照组比较：*P＜0.05**P＜0.01, 下同 *P < 0.05 **P < 0.01 vs controlgroup, same as below 图 1 百里醌对SKOV3细胞胞核蛋白Nrf2及胞浆蛋白Keap1、p-Akt、Akt表达的影响(x± s , n = 5) Fig.1 Effect of thymoquinone on protein expression of nuclear Nrf2 as well as Keap1, p-Akt, and Akt in SKOV3 cells (x± s , n = 5)

与对照组比较，百里醌组NQO1、GCLCmRNA和蛋白表达均下调，差异显著（P＜0.05、0.01）。结果见图 2、3。

图 2 百里醌对SKOV3细胞中NQO1和GCLC mRNA表达的影响 (x± s , n = 5)Fig.2 Effect of thymoquinone on expression of NQO1 and GCLC mRNA in SKOV3 cells (x± s , n = 5)

图 3 百里醌对SKOV3细胞中NQO1和GCLC蛋白表达的影响 (x± s , n = 5) Fig.3 Effect of thymoquinone on expression of NQO1 and GCLC proteins in SKOV3 cells (x± s , n = 5)

百里醌组平均肿瘤质量为（0.43±0.06）g，与对照组［（0.79±0.10）g］比较，瘤质量明显减轻（P＜0.01），抑瘤率为45.6%。

免疫组化染色可见百里醌组肿瘤组织中Nrf2、NQO1和GCLC阳性表达率分别为（28.5±2.9）%、（27.0±3.4）%和（17.6±1.6）%，对照组中分别为（36.9±3.9）%、（44.4±5.0）%和（31.4±3.8）%；与对照组比较，百里醌组肿瘤组织中Nrf2、NQO1和GCLC阳性表达率均下降，差异显著（P＜0.05、0.01）。结果见图 4。

图 4 百里醌对肿瘤组织中Nrf2、NQO1和GCLC表达的影响 (x± s , n = 5) Fig.4 Effect of thymoquinone on expression of Nrf2, NQO1, and GCLC in tumor tissue (x± s , n = 5)

本实验结果表明，百里醌能抑制体外卵巢癌细胞的生长，同时细胞凋亡检测表明百里醌能有效诱导卵巢癌细胞凋亡。在体内移植瘤模型中，也观察到百里醌明显抑制卵巢癌移植瘤生长。进一步研究发现百里醌的抗肿瘤机制可能与其氧化应激相关。

氧化应激是体内的ROS超过了机体的抗氧化防御机制的一种病理状态，为了减少ROS对细胞的损害，细胞内有一系列有效的抗氧化防御体系。NQO1、GCLC等抗氧化酶均能降低过氧化物的形成，保护细胞膜结构和功能完整^[6]。

NQO1酶属于II相解毒酶，能够借助NADH或NADPH作为电子供体，催化醌类化合物的还原反应。体内的醌类被还原有2种方式：一种是单电子反应，生成活泼的半醌类物质，进而产生大量ROS，对细胞造成氧化损伤；另一种是双电子还原反应，由II相解毒酶催化，醌类直接被还原成氢醌，氢醌稳定易被排泄。NQO1酶能催化后一种反应，避免生成大量的ROS，从而保护细胞不被氧化损伤。

还原型谷胱甘肽（GSH）具有较强的抗氧化能力，能使细胞免受各种有害物质（如氧化剂、亲电子物质等）的损伤，通过谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的催化作用清除体内多余的氧自由基。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）是合成GSH的限速酶，其催化亚基GCLC具有全酶活性。GCLC是通过合成GSH实现其抗氧化作用^[7]。

本实验结果显示百里醌作用于卵巢癌SKOV3细胞后，细胞内ROS水平明显升高，而细胞内NQO1、GCLCmRNA和蛋白水平均下降；免疫组化结果显示百里醌能明显抑制抗氧化酶NQO1、GCLC在体内肿瘤中的表达。百里醌使体内外卵巢癌抗氧化酶的表达减少，使体内清除氧自由基的能力下降，增加ROS的产生，促进卵巢癌细胞的凋亡。

Nrf2属于CNC转录因子家庭成员，是参与细胞内抗氧化应激反应的一种重要转录因子。Nrf2包括6个功能域，分别命名为Neh1～Neh6，正常情况下，Nrf2主要定位于细胞质内，活性由负性调节蛋白Keap1调控。Nrf2包括2个重要的保守区域，与Keap1相互作用后被固定于细胞质中的位点上，同时可被Keap1通过泛素化迅速降解^{[8, 9, 10]}。

当细胞受到激活剂的信号攻击后，激活PI3k/Akt途径，使位于细胞质的Akt转移到细胞膜上获得催化，Akt通过蛋白激酶对其Ser473和Thr308磷酸化而被激活^{[11, 12]}。p-Akt可使下游靶基因产物Nrf2磷酸化，活化的Nrf2从Keap1中解离，易位进入细胞核，与小Maf蛋白等结合成异二聚体，识别抗氧化反应元件ARE，从而激活多种抗氧化基因和II相酶基因的转录，如NQO1、GCLC、SOD等^[13]。这些酶直接和间接地参与ROS的清除，增加GSH和NADPH的合成，还可以加速致癌物的排除。

本实验结果表明，与对照组相比，百里醌组胞核Nrf2蛋白表达明显减少，而Keap1蛋白表达显著增加。这表明百里醌干预后SKOV3细胞内Nrf2在核内表达减少，可能是由于Keap1蛋白表达增加，加强了对Nrf2的结合抑制，并通过泛素化促进其降解。本实验同时发现，与对照组相比，百里醌组p-Akt蛋白表达亦减少，这表明百里醌可能同时通过抑制Akt的磷酸化，来减少Nrf2的活化。进而减少抗氧化酶NQO1、GCLC等在体内的表达，使肿瘤体内氧化与抗氧化失衡，产生大量的ROS，促进肿瘤细胞凋亡。

综上所述，百里醌可能通过促进Keap1蛋白表达、抑制Akt磷酸化、进而抑制Nrf2核转位，减少多种抗氧化酶和II相酶的表达，促进卵巢癌细胞内ROS水平增加，诱导凋亡。