胃癌是世界上第4类常见的恶性肿瘤，是癌症致死的第2大病因^[1]。大部分患者确诊时已处于晚期阶段，往往伴随着肿瘤的远处转移，导致患者的生存率低下。胃癌的发生与发展与表皮生长因子受体（EGFR）密切相关，表现为EGFR蛋白过表达和EGFR突变，高表达EGFR与肿瘤远处转移、治疗以及疾病自愈有显著相关性^{[2, 3]}。在胃癌细胞中，EGFR激活会促进胃癌细胞的增殖与分化，抑制EGFR的表达有利于抑制癌变^[4]。

石斛是我国传统名贵中药，自古以来就有“药中黄金”的美称。石斛首载于《神农本草经》，列为上品，谓“味甘，平，无毒，主伤中，除痹，下气，补五脏虚劳，强阴，就服厚肠胃，轻身，延年，长肌肉，逐皮肤邪热，痱气，定志除惊”。以铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo为主药的铁皮枫斗晶、铁皮枫斗颗粒（胶囊）是临床常用的辅助治疗药物，能显著减轻放疗副反应^{[5, 6]}。研究发现铁皮石斛具有调节免疫的作用^[7]，能提高非特异性免疫功能、特异性细胞免疫以及体液免疫功能^[8]；鲍丽娟等^[9]研究发现，4种石斛（霍山石斛、铁皮石斛、金钗石斛、马鞭石斛）不同溶剂（水、石油醚、醋酸乙酯及正丁醇）提取物对体外人宫颈癌HeLaS3和肝癌细胞株HepG2具有抑制作用、可诱导细胞凋亡、抑制原癌基因c-myc的表达，且在所选浓度范围内呈剂量依赖性和时间依赖性。本实验考察铁皮石斛提取物（Dendrobium officinale extract，DOE）对大鼠胃癌癌变的抑制作用，以及对EGF/EGFR、Bax/Bcl-2表达的调节作用，以期阐明DOE预防胃癌癌变的作用及机制，为临床用药提供科学依据。

DOE（含多糖45%，金华寿仙药业有限公司，批号SXG 131208）；维A酸片（山东良福制药有限公司，批号140101）；甲基硝基亚硝基胍（MNNG，日本TCI，批号MV340RC）；TUNEL System、Eastep通用型总RNA提取试剂盒、GoScript^TMReverse Transcription System（美国Promega公司）；FastStart Essential DNA Green Master（Roche）；EGF、EGFRELISA试剂盒（武汉优尔生科技股份有限公司）。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

Wistar大鼠，雄性，体质量130～150 g，清洁级，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SGXK（京）2012-0001。

Veriti^TM96梯度PCR仪（ABI）；LightCycler96荧光定量PCR仪（Roche）；Nano Drop2000分光光度计（Thermo Scietific）。

Wistar大鼠随机分为5组：对照组，模型组，DOE高、低剂量组，阳性药（维A酸片）组，每组13只。模型组与给药组每10天ig MNNG 200 mg/kg（1次），持续3个月，诱导胃癌癌变模型^[10]。造模同时ig给予DOE 4.8、2.4 g/kg，维A酸片0.012 g/kg，每天给药1次，连续给药3个月，对照组和模型组给予等体积的生理盐水。

给药结束后，大鼠ip给予2%戊巴比妥钠（45 mg/kg）麻醉，腹主动脉取血，肝素钠抗凝，3 000 r/min离心20 min后取血浆，用于测定EGF、EGFR蛋白表达。同时取胃组织，沿胃大弯切开，沿大、小弯方向将前胃切成2mm宽的长条，生理盐水冲洗干净后，分成2部分，一部分放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于HE染色与TUNEL检测；另一部分放入−80℃保存，用于提取RNA。

取4%多聚甲醛固定的胃组织，常规石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察前胃黏膜组织学变化。

取4%多聚甲醛固定的胃组织切片，按照TUNEL试剂盒所示步骤进行染色，荧光显微镜观察。凋亡图片用Image J程序分析处理。每张图片在高倍镜下随机取10个视野，计算阳性细胞数和总细胞数比值，即为凋亡率。

取血浆，按照ELISA试剂盒说明书检测血浆中EGF、EGFR蛋白水平。

RNA提取按照试剂盒说明书完成，电泳分析纯度，分光光度计测定浓度。按照试剂盒说明书进行RNA的逆转录及荧光定量。引物序列见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 实时荧光定量PCR引物序列 Table 1 Realtime qPCR primers 引物名称 引物序列 (5’-3’) EGFR 正向 CTCGTGGAACCTCTCACACC 反向 AAATGCTCCTGAACCCAGAA EGF 正向 AGGGATGTGGGGGACTTACT 反向 CATTCTTGGGCTGTTGGTGT Bax 正向 CCGATTCATCTACCCTGCTG 反向 TGAGCAATTCCAGAGGCAGTT Bcl-2 正向 GGTGGACAACATCGCTCTG 反向 CAGCCAGGAGAAATCAAACA β-actin 正向 CCCATCTATGAGGGTTACGC 反向 TTTAATGTCACGCACGATTTC

表 1 实时荧光定量PCR引物序列 Table 1 Realtime qPCR primers

数据均以x± s 表示，应用SPSS20.0软件进行组间t检验。组间癌变率比较采用Fisher检验。

造模后各组大鼠体质量均有下降，模型组和DOE组相差不大，而阳性药组体质量下降明显。在造模过程中，模型组大鼠死亡1只，DOE高剂量组死亡1只，死亡大鼠腹部胀满，尸检发现，大鼠胃胀明显，食物残留较多。研究表明MNNG会导致大鼠全消化道胀气，增加动物死亡率^[11]。阳性药组大鼠死亡5只，尸检发现大鼠肝脏发白，根据文献报道^[12]全反式维A酸片10 mg/kg给药4周出现肝脏系数明显升高，说明阳性药有一定的肝毒性。

对照组大鼠胃黏膜无淋巴细胞；模型组大鼠胃黏膜鳞状上皮破坏，层次和极性紊乱，肿瘤细胞有异型性，胞核增大，核染色质增粗，浸润性生长，呈癌变特征，同时还有间质纤维母细胞增生；阳性药组，胃黏膜鳞状细胞乳头状瘤伴轻度异型增生，鳞状上皮呈乳头状排列，细胞有轻度异型性，层次增多，乳头中央有纤维脉管束；DOE高剂量组，细胞乳头状瘤，鳞状上皮呈乳头状排列，细胞无异型性，但层次增多；DOE低剂量组，鳞状细胞乳头状增生，有轻度异型性及角化不全。可见高剂量DOE能够明显抑制胃癌癌变，主要使乳头状瘤未发生癌变。结果见图 1。

图 1 各组大鼠胃组织癌变病理学改善情况Fig.1 Pathological improvement of gastric carcinogenesis in rats

MNNG诱导的胃癌癌变病理过程是异型增生→鳞状细胞瘤→乳头状瘤→癌变。模型组的癌变发生率为41%。经Fisher精确检验，DOE高剂量组与模型组比较，能够显著抑制癌变（P＜0.01）。结果见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 DOE对胃癌大鼠癌变率的影响 Table 2 Effects of DOE on regulating rate of carcinogenesis in rats 组别 剂量/ (g·kg−1) n 胃癌癌变病理变化过程/只(%) χ2值 P值 癌变 乳头状瘤 鳞状细胞瘤 异型增生 模型 — 12 5 (41%) 6 (50%) 1 (9%) 0 — — 维A酸片 0.012 8 0 3 (38%) 0 5 (62.5%) 5.702 0.097 DOE 4.8 12 0 3 (30%) 0 7 (42.8%) 13.534 0.001## 2.4 13 1 (0.8%) 9 (69%) 3 (23%) 0 3.969 0.172 与模型组比较：##P＜0.01，下同 ##P< 0.01 vs model group, same as below

表 2 DOE对胃癌大鼠癌变率的影响 Table 2 Effects of DOE on regulating rate of carcinogenesis in rats

MNNG诱导后，模型组大鼠胃组织中EGF、EGFR mRNA表达与血浆中EGF、EGFR蛋白水平均明显升高，与对照组比较差异显著（P＜0.05），给予DOE后，高、低剂量都能显著降低EGF、EGFR表达，与模型组比较差异显著（P＜0.05、0.01），结果见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 DOE对大鼠胃组织EGF、EGFR mRNA以及血浆中EGF、EGFR蛋白表达的影响 Table 3 Effectsof DOE on expression of EGF and EGFR mRNA in gastric tissue and proteinexpression of EGF and EGFR in plasma of rats (x± s ) 组别 剂量/ (g·kg−1) n 胃组织mRNA水平 血浆蛋白水平 EGF EGFR EGF EGFR 对照 — 13 1.256±0.886 0.966±0.386 6.545±2.787 1.846±0.987 模型 — 12 4.342±1.004 3.836±1.091 16.693±4.263 5.504±2.011 维A酸片 0.012 8 3.491±1.006 1.420±0.630# 2.940±1.736## 3.058±0.955 DOE 2.4 12 0.813±0.277## 0.550±0.219## 1.614±0.591## 2.279±0.948# 4.8 13 0.762±0.268## 0.481±0.301# 0.623±0.311## 1.650±1.206## 与对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05，下同 *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vsmodel group, same as below

表 3 DOE对大鼠胃组织EGF、EGFR mRNA以及血浆中EGF、EGFR蛋白表达的影响 Table 3 Effectsof DOE on expression of EGF and EGFR mRNA in gastric tissue and proteinexpression of EGF and EGFR in plasma of rats

模型组大鼠胃组织中促凋亡基因Bax表达下降、抗凋亡基因Bcl-2表达升高（P＜0.05），给予维A酸片和DOE后，都能够得到改善，DOE高剂量组效果最明显，与模型组比较差异显著（P＜0.01）。TUNEL法检测细胞凋亡，对照组、模型组只有少数细胞发生凋亡，凋亡率分别为（3.56±0.60）%、（4.73±1.25）%，各给药组都能观察到凋亡细胞增多，阳性药组及DOE高、低剂量组的凋亡率分别为（10.12±1.34）%、（32.89±2.24）%、（12.23±1.58）%，与模型组比较差异显著（P＜0.05、0.01）。说明DOE具有明显诱导细胞凋亡的作用。结果见表 4、图 2。

图 2 TUTEL法检测DOE诱导细胞凋亡的作用Fig.2 Induction of DOE on apoptosis in each group by TUTEL

表 4(Table 4)

表 4 DOE对大鼠胃组织Bax、Bcl-2 mRNA表达以及细胞凋亡率的影响 Table 4 Effects of DOE on expression of Bax, Bcl-2 mRNA and apoptotic rate in gastric tissue of rats (x± s ) 组别 剂量/(g·kg−1) n Bax Bcl-2 凋亡率/% 对照 — 13 1.126±0.350 0.432±0.124 3.56±0.60 模型 — 12 0.511±0.150 0.709±0.158 4.73±1.25 维A酸片 0.012 8 1.050±0.168## 0.298±0.087## 10.12±1.34# DOE 2.4 12 1.048±0.223## 0.341±0.136# 12.23±1.58# 4.8 13 1.653±0.286## 0.524±0.191## 32.89±2.24##

表 4 DOE对大鼠胃组织Bax、Bcl-2 mRNA表达以及细胞凋亡率的影响 Table 4 Effects of DOE on expression of Bax, Bcl-2 mRNA and apoptotic rate in gastric tissue of rats

胃癌动物模型所用的MNNG具有很强的致癌力，直接破坏DNA，易渗透胃幽门部和胃底黏膜，且胃对其转化失活能力最差，因而其诱发胃癌具有特异性。徐晶莹等^[13]以100 mg/mL MNNG的5%的酒精水溶液作为Wistar雄性大鼠常规饮用水24周，之后加在饲料中至28周，成功直接诱发大鼠胃腺癌。此法操作简便，排除了对胃的某些非特异性损伤，模型与人胃癌的自然发生机制相似，但饮用剂量难以精确掌握，而且周期长，所以本实验参考文献中单因素造模方法^{[10, 14]}，ig给予200 mg/kg MNNG，每隔10 d一次，持续3个月，成功造成胃癌模型。

胃癌发生发展的过程很少直接从胃黏膜上皮产生，而是由多基因异常引起的渐进性变化，在癌变前多数经历了较长的演变，即由正常胃黏膜转变成为癌前病变，部分发展成胃癌。EGFR家族是受体型酪氨酸激酶中研究得最为透彻的信号通路，在很多恶性肿瘤如乳腺癌、非小细胞肺癌中，均发现EGFR家族有过度表达，这些受体的激活引起肿瘤细胞繁殖、血管生成、肿瘤转移、阻滞凋亡，以EGFR家族为靶点的药物研发成为研究的热点。胃癌的发生与发展与EGFR具有密切的关系，表现为EGFR蛋白过表达和EGFR突变。陈斌等^[15]在胃癌组织中测定EGFR蛋白的阳性表达率为42.7%（44/103），在胃对照组织中无表达。Kim等^[16]也发现EGFR在胃癌组织中的阳性表达率为5%～25%，Hirao等^[17]发现EGFR反义转染后MKN28胃癌细胞体内、体外生长受到抑制。进而认为EGFR可能成为判断胃癌发生、发展、预后的标志物^{[18, 19]}。更有趣的是MNNG可以引起EGFR和肿瘤坏死因子受体（TNFR）等膜受体聚簇，以及下游信号分子NF-κB的活化^{[20, 21]}。本实验模型组可见EGFR大量表达，DOE能够有效减少EGF、EGFR mRNA的表达，抑制胃癌癌变，具体怎样诱导细胞凋亡的发生，可能与抑制EGF/EGFR下游通路的表达有关。

EGF与EGFR结合后，将外界各种信号转导至胞内^[22]，主要通过2条途径将信号传递入核：一条是Ras-Raf-MEK-ERK途径，这个级联反应通路主要受一些生长因子的刺激而激活。ERK活化后进入核内，在核内磷酸化转录因子，从而激活早期快反应基因，进而调节基因转录，促进细胞有丝分裂和增殖^[23]。ERK的活化能上调EGFR的表达，从而形成了对肿瘤细胞生长起关键作用的自分泌环^[24]。另一条是PI3K/Akt，PI3K/Akt通路能够调节许多细胞功能，例如细胞生长、增殖、分化以及细胞粘附能力和迁移性。当Akt被激活后，能够磷酸化抑癌基因p21以及促凋亡基因Bad、Caspase-9和NF-κB从而阻止凋亡和促进上皮细胞存活^[25]。本实验发现胃癌癌变组促凋亡基因Bax mRNA表达下降、抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达升高，能够抑制胃组织的细胞凋亡，给予DOE后能够促进凋亡，推测可能与PI3K/Akt通路的活化有关，将在后续的实验中进一步去探索。

铁皮石斛有效成分为多糖、生物碱、菲类化合物、氨基酸以及微量元素^[26]。铁皮石斛多糖是抗肿瘤的主要有效成分^[27]，刘亚娟等^{[28, 29]}证实铁皮石斛多糖可以提高小鼠胚胎干细胞的克隆形成率，促进其增殖，同时又不影响其多潜能性的维持和表达；而且铁皮石斛多糖可以抑制HepG2、A549、NCCIT及F9的生长，具有一定的抗癌活性。葛颖华等^[30]证实鲜铁皮石斛多糖对Lewis肺癌小鼠有明显的免疫调节作用。王杰等^[31]证实鲜铁皮石斛多糖提取物对Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤有明显的抑制作用，其作用机制可能与提高脾脏指数、调节血清中TNF-α、IL-2水平有关。本研究中，DOE明显抑制胃癌癌变，降低胃组织中EGF、EGFR mRNA以及血浆中EGF、EGFR蛋白水平，明显升高Bax mRNA表达、降低Bcl-2 mRNA的表达，诱导细胞凋亡。DOE中多糖质量分数达到45%，其抑制胃癌癌变的作用，可能和多糖有关，但否是多糖起主要作用，还需进一步证实。