芦丁是一种重要的黄酮类化合物，具有消炎、镇痛、抗病毒、抗肿瘤等各种生物活性^{[1, 2]}，主要用于治疗脑出血、出血性肾炎、高血压、慢性支气管炎等症。芦丁广泛存在于芸香科和石楠科植物中，植物资源丰富，提取方法主要有碱提取酸沉淀法、热水提大孔吸附树脂法等^{[3, 4, 5]}，由于药用植物中黄酮类物质繁多，结构相似，芦丁的分离提取不理想。

分子印迹技术具有锁钥特点和选择性识别功能，近年来在中药有效成分提取中应用越来越多^{[6, 7, 8, 9]}。目前分子印迹聚合物（molecular imprinted polymer，MIP）的识别位点大多通过静电引力、氢键、范德华力等非共价作用，MIP需在非水的弱极性有机溶剂中制备，分子印迹技术存在印迹聚合物稳定性差、耗费有机溶剂多及毒性大等不足^[10]。金属配位键强度高于氢键及范德华力，具有方向性，可制备出结构更稳定，选择性更好的MIP^[11]。同时，金属配位键在极性溶剂中可保持稳定，可有效克服印迹聚合物只能在弱极性溶剂中制备的不足，减少有机溶剂的使用，拓展分子印迹技术的应用。

本实验以芦丁-Cu²⁺为模板，通过配位键在强极性环境中合成了芦丁-Cu²⁺配合物印迹聚合物。芦丁-Cu²⁺配合物印迹聚合物环境耐受性好，对目标分子吸附能力强，选择性好，可用于中药有效成分芦丁的分离与富集。

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芦丁对照品，质量分数为98%，批号135042，北京万佳首化生物科技有限公司；α-甲基丙烯酸（MAA）、乙二醇二丙烯酸酯（EDMA）、偶氮二异丁腈（AIBN）均为百灵威试剂，硫酸铜购自济宁恒泰化工有限公司。

精密称取710 mg芦丁和480 mg硫酸铜溶于15 mL四氢呋喃-甲醇（1∶3）溶液，超声震荡3 h，使芦丁和Cu²⁺配位完全。向金属配合物中加功能单体MAA 4 mmol，超声3 h使配合物与功能单体充分作用；加入EDMA 20 mmol、AIBN 50 mg；通氮除氧20 min，水浴60 ℃加热反应24 h。所得棒状聚合物研钵磨碎过300目筛，用乙酸、甲醇体积比1∶9混合溶液索氏提取除去模板分子。用EDTA溶液洗涤除去Cu²⁺，然后用甲醇、水反复洗涤，60 ℃干燥至恒定质量。

不加芦丁和硫酸铜，以上述步骤制备非印迹聚合物（NIP）。

芦丁紫外光谱有2个强吸收峰，分别在220、365 nm，其中220 nm属于A环n-π电子跃迁，365 nm属于B环π-π电子跃迁。B环中3′,4′-二羟基和C环中的5-羟基-4-酮都容易与金属离子配位，形成稳定的环状配合物，芦丁与铜饱和配位比为1∶2。以四氢呋喃-甲醇（1∶3）为溶剂，配制浓度为0.02 mmol/L的芦丁溶液5份，向溶液中分别加入CuSO₄固体，配制芦丁和Cu²⁺的浓度比依次为1∶0、1∶0.3、1∶0.5、1∶1.2、1∶2的系列溶液。将溶液放入恒温振荡器，恒温振荡（300 W，150 r/min）4 h，测定紫外光谱。

由图 1可知，芦丁浓度固定不变，逐渐增大Cu²⁺的浓度，芦丁220 nm处的吸收峰强度整体呈下降趋势，365 nm处的吸收峰强度渐次减小。当芦丁与Cu²⁺浓度比为1∶2时，365 nm吸收峰已非常弱，接近消失，同时，芦丁与Cu²⁺浓度比为1∶2时吸收曲线在420 nm吸收明显增强。说明芦丁与Cu²⁺形成了一种配合物。

图 1 芦丁-Cu2+配位分子紫外吸收曲线Fig.1 Ultra-violet absorption curves of rutin-Cu2+

分别测定芦丁及芦丁-Cu²⁺聚合物红外光谱，研究聚合物的生成及芦丁结构的变化。图 2-a为芦丁红外光谱图，3 422 cm⁻¹吸收峰为苯环羟基伸缩振动，1 652 cm⁻¹为羰基吸收峰，1 592、1 507 cm⁻¹吸收峰对应苯环骨架伸缩振动；1 457 cm⁻¹为亚甲基的剪式振动吸收峰，1 011～1 203 cm⁻¹对应碳氧键的伸缩振动。图 2-b为芦丁-Cu²⁺聚合物红外光谱，从图中可以看出，芦丁由于配位聚合物的形成，羟基峰明显减弱并向低波数移动，说明芦丁羟基参与了配位；羰基峰有所加强并向高波数移动；由于聚合物的形成，限制了苯环的伸缩振动，其对应吸收峰减弱并合并为1个。

a-芦丁 b-芦丁-Cu2+聚合物 a-rutin b-rutin-Cu2+ polymer 图 2 红外光谱Fig.2 Infrared spectra of rutin and polymer

精密称取8份印迹聚合物，分别置于5 mL系列浓度变化的芦丁溶液（0.2～5 mmol/L，含有Cu²⁺，c_Cu2+∶c_芦丁＝2∶1）中，将溶液放入恒温振荡器中于30 ℃下振荡，然后离心分离，测定芦丁浓度，按照下式求印迹聚合物对芦丁的吸附量（Q），绘制结合曲线。

Q＝(c₀－c_t)×V/m

c₀为芦丁的初始浓度（mmol/L），c_t为吸附后芦丁的平衡浓度（mmol/L），V和m分别为溶液的体积（mL）和聚合物的质量（g）

由图 3可知，随着芦丁-Cu²⁺浓度逐渐增大，MIP、NIP对芦丁-Cu²⁺的吸附量均呈现增加趋势，但在整个浓度范围内，MIP吸附量均大于NIP，对底物吸附能力更强，说明印迹聚合物对芦丁-Cu²⁺具备了一定的印迹功能，可以依靠配位键位点作用及结构匹配实现对芦丁-Cu²⁺的特性吸附。而对于NIP，虽然芦丁也能与聚合物上的羧基形成氢键，但由于结构及位置关系，不具有作用位点的匹配性，每个芦丁分子往往只能与吸附剂形成1个氢键，这样作用力远小于MIP对芦丁的作用力，因此NIP对芦丁吸附力很弱。

图 3 聚合物吸附等温线Fig.3 Adsorption isothermals of polymer

采用Scatchard方程对吸附特点进行进一步分析：Q/C＝(Q_max－Q)/K_d，C为吸附平衡浓度，根据Q/C、Q线性关系，由斜率和截距可求得平衡解离常数（K_d）和最大表观结合量（Q_max）。如图 4所示，Scatchard曲线包含2条直线，2条直线斜率不同但线性良好，说明印迹聚合物与模板分子具有2种不同的特异性结合作用。根据直线斜率与截距求出结合能力较强和较弱的K_d分别为1.69、2.90 mmol/L，Q_max分别为31.77、346.20 μmol/g。

图 4 聚合物Scatchard曲线Fig.4 Scatchard curve of of polymer

选取与芦丁结构相似的黄芩素、葛根素、儿茶素作为对照物，按照“2.1”项所示方法制备相应Cu²⁺配合物，配制相同浓度芦丁-Cu²⁺、黄芩素-Cu²⁺、葛根素-Cu²⁺和儿茶素-Cu²⁺配合物溶液，计算结合量，研究芦丁-Cu²⁺印迹聚合物的吸附选择性。

由表 1可见，MIP对芦丁的结合量明显大于NIP的结合量，并且比MIP对其他3种物质的结合量都大，均达到2倍以上，表现出了较好的选择性。同时，MIP对黄芩素、儿茶素的吸附量反而比NIP小，原因是MIP形成的三维立体构形适合于芦丁- Cu²⁺的空间结构，虽然黄芩素、儿茶素与芦丁结构相似，但二者金属配合物与芦丁金属配合物结构差异较大，MIP对黄芩素-Cu²⁺、儿茶素-Cu²⁺的结合量比非印迹聚合物小说明MIP具有良好的选择性。

表 1(Table 1)

表 1 聚合物对不同底物吸附量 Table 1 Adsorption of polymer to different substrates 聚合物 吸附量/(μmol∙g−1) 芦丁 黄芩素 葛根素 儿茶素 MIP 58.3 23.0 18.4 21.4 NIP 32.1 32.6 16.7 24.9

表 1 聚合物对不同底物吸附量 Table 1Adsorption of polymer to different substrates

配制5 mL浓度为0.8、2.5 mmol/L的芦丁溶液（含有Cu²⁺，c_Cu2+∶c_芦丁＝2∶1）各1份，分别加入MIP 30 mg，按“2.4”方法计算聚合物吸附量；过滤掉聚合物，用乙酸-甲醇（1∶9）溶液洗脱模板分子，重复上述吸附试验，连续吸附5次，记录聚合物每次吸附量，结果见表 2，经过5次吸附后，所制备MIP吸附量没有明显下降，表现出较好的吸附稳定性。

表 2(Table 2)

表 2 聚合物稳定性 Table 2 Stability of MIP 初始浓度/ (mmol∙g−1) 吸附量/(μmol∙g−1) 1次吸附 2次吸附 3次吸附 4次吸附 5次吸附 0.8 24.2 23.8 23.1 23.6 23.0 2.5 37.4 36.7 37.1 37.0 36.8

表 2 聚合物稳定性 Table 2Stability of MIP

本实验在极性溶剂中制备了芦丁-Cu²⁺配位印迹聚合物，EDMA为交联剂，MAA为功能单体。紫外光谱、红外光谱实验证实，芦丁-Cu²⁺与功能单体通过配位键相结合，形成了结构稳定的聚合物；通过静态吸附试验及对结构类似物的吸附表明，印迹聚合物对芦丁-Cu²⁺具有良好的特异性吸附。所制备的印迹聚合物可用于中药有效成分芦丁的提取与富集。