秋水仙碱为百合科植物丽江山慈菇Iphigenia indica Kunth et Benth. 的球茎中提取到的一种生物碱^[1]，是治疗急性痛风性关节炎的首选药物。由于秋水仙碱毒性较大，将其制备成透皮制剂，有利于发挥其局部治疗作用，同时可避免口服引起的胃肠道反应、骨髓毒性反应等严重副作用^{[2, 3, 4]}。

醇质体（ethosomes）是一种新型的含有一定量小分子醇且具有囊泡结构的纳米给药载体，具有变形性强、包封率高、刺激性小等优点，用于经皮给药能显著提高透皮吸收速率和药物皮内滞留量，具有延缓药物释放的作用^{[5, 6, 7]}。

聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（TPGS）是由维生素E琥珀酸和聚乙二醇酯化而成，是一种具有较高安全性的非离子型表面活性剂，可显著提高纳米药物制剂的包封率^{[8, 9]}。本实验通过均匀设计试验优化含TPGS秋水仙碱醇质体处方，并对含TPGS秋水仙碱醇质体、普通秋水仙碱醇质体及秋水仙碱30%乙醇溶液的体外经皮渗透性能进行比较，为秋水仙碱经皮给药制剂的研制提供实验依据^{[10, 11, 12]}。

Waters高效液相色谱仪，Alliance2695四元泵及自动进样系统，2996二极管矩阵检测器，Empower色谱工作站；AT201型1/10万电子天平，瑞士梅特勒公司；Milli-Q型纯水器，美国Millipore公司；78-1型磁力加热搅拌器，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；Zetasizer Nano-ZS 90型马尔文激光散射粒径测定仪，英国马尔文公司；JY92-2D超声波细胞粉碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；YB-P6智能透皮试验仪，天津市鑫洲科技有限公司，有效扩散面积0.785 cm²，接收池体积10 mL；JEM-2100透射电镜，日本电子公司；Microfuge-16离心机，Beckman公司。

秋水仙碱原料药，批号20140320，质量分数≥98%，南京泽朗医药科技有限公司；秋水仙碱对照品，批号101176-201202，由中国食品药品检定研究院提供，质量分数＞98%，供定量测定用。注射用大豆磷脂，上海太伟药业有限公司；葡聚糖凝胶（Sephadex G-50），北京瑞达恒辉科技发展有限公司；TPGS，Sigma公司。甲醇为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

实验动物为昆明种小鼠，雄性，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2013-0015。

采用注入超声法制备：称取秋水仙碱20 mg、大豆磷脂350 mg和TPGS 50 mg，加入7.3 mL无水乙醇，置于磁力搅拌器上，完全溶解后，在密闭条件下缓慢细流注入12.7 mL水，保持温度为30 ℃，待水注完后继续磁力搅拌10 min，然后冰水浴条件下探头式超声5 min（200 W，超声5 s，停5 s），将得到的样品冷藏、备用^[13]，即得含TPGS秋水仙碱醇质体。同法制备不含TPGS的普通秋水仙碱醇质体及不含秋水仙碱的空白含TPGS醇质体。

色谱柱为Alltima C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（60∶40）；体积流量为1 mL/min；检测波长为254 nm；柱温35 ℃；进样量20 μL。

精密称取秋水仙碱对照品适量，加甲醇超声溶解、定容，制成质量浓度为109.0 μg/mL的对照品储备液。

分别取适量秋水仙碱对照品溶液、含TPGS秋水仙碱醇质体溶液和空白含TPGS醇质体溶液，加甲醇稀释，超声破乳，微孔滤膜滤过，取续滤液，按“2.2.1”项色谱条件进样测定。秋水仙碱色谱峰峰形良好，辅料及溶剂对药物测定无干扰（图 1）。

图 1 秋水仙碱对照品 (A)、含TPGS秋水仙碱醇质体 (B) 和空白含TPGS醇质体 (C) 的HPLC色谱图Fig.1 HPLC of colchicines (A), ethosomes containing TPGS (B), and blank ethosomes (C)

精密吸取秋水仙碱对照品储备液，依次稀释成含秋水仙碱109、87.2、65.4、43.6、21.8、10.9 μg/mL的系列对照品溶液，分别取系列对照品溶液20 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积。以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，求得回归方程为Y＝1.59×10⁶ X－1.08×10⁵，r＝0.999 8，结果表明，秋水仙碱进样量在0.218～2.180 μg与峰面积呈良好的线性关系。

取秋水仙碱对照品溶液，连续重复进样6次，其RSD为0.36%，表明仪器精密度良好。

取同一批次含TPGS秋水仙碱醇质体6份，加甲醇稀释，超声破乳，微孔滤膜滤过，取续滤液，按“2.2.1”项色谱条件进样检测。结果RSD为2.1%，表明该方法重复性良好。

取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10 h进样检测。结果RSD为1.2%，表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

制备空白含TPGS醇质体，分别加入不同量的秋水仙碱对照品溶液于量瓶中，用甲醇破乳、稀释定容，使秋水仙碱质量浓度分别为21.08（低）、52.70（中）、84.32（高）μg/mL，每个质量浓度各配制3份。进样检测，结果低、中、高质量浓度的秋水仙碱的平均回收率分别为99.7%、101.5%、100.8%，RSD分别为2.8%、2.2%、2.5%。

采用微柱离心法测定包封率。取含TPGS秋水仙碱醇质体混悬液0.5 mL，从Sephadex G-50微柱凝胶顶端加入，每次用0.5 mL水在3 000 r/min的条件下离心3 min，洗脱2次，收集带有乳光的洗脱液于25 mL量瓶，甲醇定容，微孔滤膜滤过，进样检测，计算包封药物量（W_包）^[14]。取含TPGS秋水仙碱醇质体混悬液0.5 mL，不经微柱离心，甲醇稀释相同倍数，微孔滤膜滤过，进样检测，计算醇质体中药物总量（W_总），计算包封率（包封率＝W_包/W_总）。

取与含TPGS秋水仙碱醇质体中秋水仙碱质量浓度相同的秋水仙碱溶液0.5 mL，按上述方法过Sephadex G-50微柱凝胶，收集滤液，甲醇定容至25 mL，微孔滤膜滤过，进样检测，峰面积为A_后。取秋水仙碱溶液0.5 mL，不经微柱离心，甲醇稀释相同倍数，微孔滤膜滤过，进样检测，峰面积为A_前，计算微柱凝胶对游离秋水仙碱的吸附率［(A_前－A_后)/ A_前］^[15]，结果为99.2%，表明微柱凝胶对游离秋水仙碱的吸附性能良好。

由表 1可知，含TPGS秋水仙碱醇质体、普通秋水仙碱醇质体的包封率平均值分别为74.71%、58.26%。含TPGS秋水仙碱醇质体与普通秋水仙碱醇质体比较，包封率显著增加（P＜0.01）。

表 1(Table 1)

表 1 包封率、粒径、多分散指数及Zeta电位测定结果 Table 1 Determination of EE, particle size, polydispersity index, and Zeta potential (x±s, n = 3) 样品 包封率/% 平均粒径/nm 多分散指数 Zeta电位/mV 普通秋水仙碱醇质体 58.26±2.32 117.3±4.7 0.413±0.014 −26.3±2.3 含TPGS秋水仙碱醇质体 74.71±2.18** 89.6±3.5** 0.201±0.008 −34.6±2.7 与普通秋水仙碱醇质体比较：**P＜0.01 **P < 0.01 vs ethosomes

表 1 包封率、粒径、多分散指数及Zeta电位测定结果 Table 1Determination of EE, particle size, polydispersity index, and Zeta potential

根据文献及预试验结果，选择对含TPGS秋水仙碱醇质体制备影响较显著的3个因素：大豆磷脂量用（A）、TPGS用量（B）、乙醇体积分数（C）作为考察对象。上述各因素取5水平，以包封率为考察指标，采用U₅(5³) 均匀设计表^[16]进行试验，因素水平、试验方案及结果见表 2，方差分析结果见表 3。利用SPSS 16.0统计软件对上述均匀设计试验

表 2(Table 2)

表 2 均匀设计试验方案及结果 Table 2 Test and results of uniform design 试验号 A/mg B/mg C/% 包封率/% 1 200 (1) 35 (2) 35 (4) 69.56 2 250 (2) 45 (4) 30 (3) 71.83 3 300 (3) 30 (1) 25 (2) 62.48 4 350 (4) 40 (3) 20 (1) 60.27 5 400 (5) 50 (5) 40 (5) 74.71

表 2 均匀设计试验方案及结果 Table 2Test and results of uniform design

表 3(Table 3)

表 3 方差分析表 Table 3 Analysis of variance 方差来源 平方和 自由度 F值 显著性 回归来源 152.078 3 6 466 P＜0.01 剩余 0.008 1 总和 152.086 4 F0.01(3, 1) = 5 403

表 3 方差分析表 Table 3Analysis of variance

结果进行逐步回归分析，得回归方程为Y＝−0.146＋3.134 C－0.043 C²＋0.378 B，r＝1.000，F＝6 466。

由表 3可知，回归方程经F检验，F＝6 466＞F_0.01(3, 1)＝5 403，故回归方程具有极显著意义，且复相关系数r＝1.000，表明该回归方程对试验过程拟合情况良好，可以据其预测包封率。

由回归方程可知，影响提取包封率的各因素作用大小顺序为乙醇体积分数（C）＞TPGS量（B）。其中大豆磷脂量（A）无显著影响作用。根据回归方程求出最佳参数为TPGS 50 mg、乙醇体积分数为36.44%。结合实际生产，拟确定最优处方为大豆磷脂350 mg、TPGS 50 mg、乙醇体积分数为36.44%，按回归方程计算，预测包封率为75.85%。按优化后处方制备3批含TPGS秋水仙碱醇质体，测定其包封率，分别为73.24%、76.61%、74.89%。由此可知，验证结果与回归方程预测结果基本接近，优选处方稳定可行，重复性好。

取适量含TPGS秋水仙碱醇质体采用激光散射粒径测定仪测定粒径和Zeta电位，结果见表 1和图 2。与普通醇质体相比，TPGS醇质体平均粒径显著减小（P＜0.01），且更均匀。

图 2 含TPGS秋水仙碱醇质体的粒径分布 (A) 和Zeta电位 (B) Fig.2 Size distribution (A) and Zeta potential (B) of colchicine ethosomes containing TPGS

将醇质体滴于铜网上，滴加3%的磷钨酸溶液进行负染，自然晾干，透射电镜观察醇质体形态并拍照，结果见图 3。由图 3可知，TPGS醇质体外观呈球形或近球形囊泡，粒子大小较均一，粒径较普通醇质体稍小，与激光散射粒径测定仪测定的粒径结果基本一致。

图 3 含TPGS秋水仙碱醇质体 (A) 和普通秋水仙碱醇质体 (B) 透射电镜照片Fig.3 Transmission electron micrographs of ethosomes containing TPGS (A) and ethosomes (B)

小鼠脱颈处死，剃去腹部皮肤上的毛，剥离腹部皮肤，去除皮下脂肪和粘连物，保证皮肤完整性，生理盐水漂洗干净后备用。将皮肤置于Franz扩散装置上，角质层面向供给池，真皮层面向接收液，透皮扩散面积为0.785 cm²，接收液为10 mL生理盐水，使液面与皮肤内层紧密接触，恒温水浴37 ℃，500 r/min磁力搅拌。供给池分别注入0.2 mL含TPGS秋水仙碱醇质体、0.2 mL普通秋水仙碱醇质体和0.2 mL秋水仙碱30%乙醇溶液（秋水仙碱质量浓度均为1 mg/mL）。分别于1、2、3、4、6、8、12、18、24 h时间点取样1 mL，并立即补充等量空白接收液^[17]。样品经微孔滤膜滤过后，进样检测，计算单位面积累积渗透药量（Q_n，μg/cm²）。

ρ_n为第n个取样点测得的秋水仙碱质量浓度（μg/mL），ρ_i为第i个取样点测得的秋水仙碱质量浓度（μg/mL），V为接收池体积（10 mL），V_i为取样体积（1 mL），A为透皮扩散面积（0.785 cm²）

以时间t为横坐标，Q_n为纵坐标，绘制经皮渗透曲线，以秋水仙碱Q_n对t进行线性回归，所得回归方程的斜率即为稳态透皮速率［J_s，μg/(cm²∙h)］。

采用皮肤剪碎法测定皮内滞留量，于24 h取下皮肤，生理盐水洗去表面残留物，剪碎皮肤，10 mL甲醇浸润24 h，再超声提取3次，每次20 min，合并提取液，水浴蒸干，10 mL甲醇超声溶解20 min，微孔滤膜滤过，进样检测，计算单位面积皮内药物滞留量（Q_s，μg/cm²）。以普通秋水仙碱醇质体、秋水仙碱30%乙醇溶液作为对照，研究含TPGS秋水仙碱醇质体的经皮渗透性质，结果见图 4和表 4。 含TPGS秋水仙碱醇质体可提高药物的Q_n。秋水仙碱在不同载体中24 h的Q_n由大到小的顺序依次为含TPGS秋水仙碱醇质体＞普通秋水仙碱醇质体＞秋水仙碱30%乙醇溶液。其中，含TPGS秋水仙碱醇质体的Q_n为（91.36±7.11）μg/cm²，分别是普通秋水仙碱醇质体、秋水仙碱30%乙醇溶液的1.42、3.27倍，且差异具有统计学意义（P＜0.01）。含TPGS秋水仙碱醇质体可提高药物的J_s。由表 4可知含TPGS秋水仙碱醇质体的J_s为（4.73±0.38）μg/(cm²∙h)，分别是普通秋水仙碱醇质体、秋水仙碱30%乙醇溶液的1.67、3.43倍，且差异具有统计学意义（P＜0.01）。由24 h的Q_s的结果可知，含TPGS醇质体可明显提高Q_s，其顺序为含TPGS秋水仙碱醇质体＞普通秋水仙碱醇质体＞秋水仙碱30%乙醇溶液。其中含TPGS秋水仙碱醇质体的Q_s为（182.84±14.37）μg/cm²，分别是普通秋水仙碱醇质体、秋水仙碱30%乙醇溶液的1.43、1.74倍，且差异具有统计学意义（P＜0.01）。

图 4 含TPGS秋水仙碱醇质体和对照制剂的经皮渗透曲线 (x±s, n = 3) Fig.4 Cumulative permeation curves of colchicine penetrating through mice skin from ethosomes containing TPGS and control groups (x±s, n = 3)

表 4(Table 4)

表 4 TPGS醇质体和对照制剂的经皮渗透参数 Table 4 Permeation parameters of colchicine ethosomes containing TPGS and control preparation (x±s, n = 3) 组别 Qn/(μg∙cm−2) Js/(μg∙cm−2∙h−1) Qs/(μg∙cm−2) 秋水仙碱30%乙醇溶液 27.91±3.03 1.38±0.11 105.17± 8.12 普通秋水仙碱醇质体 64.49±5.61 2.84±0.23 128.22±11.64 含TPGS秋水仙碱醇质体 91.36±7.11 4.73±0.38 182.84±14.37

表 4 TPGS醇质体和对照制剂的经皮渗透参数 Table 4Permeation parameters of colchicine ethosomes containing TPGS and control preparation

TPGS作为一种新型非离子表面活性剂已被FDA批准为安全的药用辅料，研究发现，TPGS具有很多特性，如作为吸收促进剂、黏膜免疫佐剂及多药耐药逆转剂等，TPGS也可应用于前体药物、胶束、脂质体提高制剂的溶解度、渗透性及稳定性，从而实现缓、控释及靶向作用。

均匀设计是常用的试验设计方法，其实验点在实验范围内充分分散，可大大减少实验次数，具有方便、适用、预测性好等优点，非常适合用于处方筛选、药理药效筛选等研究中多因素、多水平试验。通过对TPGS醇质体处方优化的均匀设计结果可知，乙醇体积分数、TPGS量对包封率均有影响。适量的乙醇可以增加膜的流动性，促使包封率提高。但是，乙醇体积分数过高时包封率反而降低，可能是由于部分磷脂溶解于乙醇，导致囊泡膜变薄。

本研究曾采用透析法测定醇质体中药物包封率，但透析法耗时较长，所耗介质较多，实验效率极低，且长时间透析也易导致药物渗漏，故最终采用微柱离心法测定药物包封率。实验证明，微柱离心法能较迅速地分离醇质体和游离药物，且方法简单，易于操作，所得包封率较高，重现性良好。

本实验表明，秋水仙碱在TPGS醇质体中Q_n、J_s及Q_s均明显高于普通醇质体，原因可能有以下2个方面：TPGS的存在使得所制备的醇质体粒径较小，而且均匀；药物包封率较高。