简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）又称微卫星（microsatellite）、串联短重复序列（short tandem repeats，STR）、简单序列长度多态性（simple sequence length polymorphism，SSLP），是一种由1～6个核苷酸组成的串联重复单元，广泛分布在真核和原核生物基因组中^[1]。基于PCR的SSR标记有重复性好、可靠性高、操作容易、共显性等特点，成为构建连锁遗传图谱、研究群体遗传学、进行分子标记辅助育种、系谱分析、品种指纹图谱绘制等的理想工具^{[1, 2]}。传统的SSR（基因组SSR，genomic-SSR）标记开发周期长、成本高。而以EST-SSR为代表的genic-SSR能直接反映基因编码蛋白信息，可与基因功能直接关联，从而直接鉴定某些重要性状；此外，由于引物来自保守度较高的基因编码区，使其在不同种属间也具有通用性，在亲缘物种之间矫正连锁图谱和比较作图方面具有较强的优势^{[1, 2]}。随着第2代测序技术的发展应用，转录组测序为genic-SSR的开发提供了较EST数据大很多的数据基础，从而加速SSR标记，特别是与重要性状关联或比较作图方面的SSR标记的开发。

茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf是一种隶属于担子菌门Basidiomycetes，多孔菌科Polyporaceae，的高等真菌，其菌核是一种传统的中药，《中国药典》2015年版收录有茯苓与茯苓皮两味药材^[3]。茯苓是一种药食两用、大宗的常用中药材，约10%的中成药（约300种）原料配方中含有茯苓^{[4, 5]}。茯苓的主要化学成分为多糖及三萜类化合物，具有抗肿瘤、抗氧化、抗惊厥等多种生物活性^[6]。茯苓主要分布于我国中部及西南各省，具有悠久的人工栽培历史，但由于很难获得其有性态担孢子，生产上育种处于长期无性繁殖，导致菌种退化；且由于菌种管理不规范，菌种名称较为混乱^{[7, 8]}。

茯苓的SSR分子标记研究尚未见文献报道，本研究通过对已获得的茯苓转录组序列进行SSR搜索，并对找出的SSR序列进行分析，同时注释其所在序列的基因功能来了解茯苓转录组序列所含SSR的序列特征及组成情况，推测其可能相关联的性状。此外，本研究还利用公开的茯苓基因组数据进行比较研究，得到转录组SSR与基因组SSR的分布与序列特征的异同。本研究可为茯苓的遗传多样性、良种选育、SSR分子标记，特别是与性状连锁基因的分子标记的开发等提供研究基础。

样品于2012年采自湖北省英山县石头咀镇的栽培地，由湖北省中医药研究院王克勤研究员鉴定为茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf菌核。根据Shu等^[9]报道，将菌核接种到PDA培养基上，进一步分离纯化得到纯茯苓菌种。分别提取茯苓菌核、菌丝RNA，利用Illumina HiSeq 2000进行转录组测序，测序结果使用Trinity软件进行从头组装，得到共含35 299 182核苷酸的Unigene 41 327条^[9]。从JGI网站（http://genome.jgi-psf.org/Wolco1/ Wolco1.home.html）^[10]下载茯苓的基因组数据作为对比参考数据，数据含348个scaffold，共50 483 556核苷酸。该基因组测序使用的是1956年分离自美国佛罗里达州阿拉楚瓦郡的茯苓单孢培养菌株MD-104 SS10。

在Ubuntu 14.04 LTS（32位）操作系统中使用MISA软件（MIcro-SAtellite identification tool，MISA，http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）对转录组Unigene及基因组scaffold序列进行SSR位点搜索。设置单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重复次数分别为15、6、5、4、3、3。复合SSR 2个位点间最大间隔碱基数为100。将生成的文本文件导入到Excel（Microsoft Office Excel 2013）中，对SSR的基本信息进行统计分析。

对茯苓转录组数据中1 887条含有SSR的Unigene序列使用BlastX比对到蛋白质数据库nr（GenBank non-redundant），比对参数e值＜10⁻⁵。根据nr蛋白注释信息，使用Blast2GO软件^[11]分析得到转录组数据中含SSR的Unigene的基因本体（gene ontology，GO）注释信息。得到每个Unigene的GO注释后，利用WEGO在线软件（http://wego.genomics.org.cn/cgi-bin/wego/index.pl）^[12]对注释的Unigene做GO功能分类统计，分析含SSR的Unigene的功能分布特征。

通过BlastX，将含SSR的Unigene序列比对到京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）数据库中，比对参数e值＜10⁻⁵。比对得到Unigene在KEGG数据库的注释信息，及其在KEGG orthology（KO）系统中的相应K编号。根据K编号将Unigene注释到相应的代谢通路上，并进行代谢通路分析。

使用SPSS 19.0.0软件对数据进行χ²检验。

本研究利用Perl脚本MISA（MIcro-SAtellite identification tool，MISA，http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）搜索茯苓转录组及其基因组序列的SSR，设置的SSR最小长度均不小于12 bp。从总长度约为35.30 Mb的41 327条转录组Unigene序列中搜索到2 197个SSR，分布于1 887条Unigene上；其中含多个SSR的Unigene占14.47%，共273条。从对比的总长度50.38 Mb的348条基因组scaffold序列中搜索到SSR 2 877个，多于从转录组数据搜索到的。然而，转录组与基因组中搜索到的SSR平均密度分别为58.78个/Mb、54.00个/Mb，转录组SSR密度略高于基因组。经统计计算，转录组SSR与基因组SSR的平均长度无显著差异，平均长度分别为19.59、20.74 bp。见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 茯苓转录组和基因组序列中SSR统计 Table 1 Description of SSR in transcriptome and genome sequences of P. cocos 项目 转录组 基因组 序列总数 41 327 348 总核苷酸数/bp 35 299 182 50 483 556 GC量/% 55.72 52.17 总SSR数 2 075 2 726 复合SSR数量* 112 135 复合SSR的比例/% 5.40 4.95 含SSR的序列数 1 887 86 含SSR序列的比例/% 4.57 24.71 含多个SSR的序列数 273 40 含多个SSR序列的比例/% 14.47 46.51 SSR密度/(个·Mb−1) 58.78 54.00 SSR平均长度/bp 19.59 20.74 *表示所在项目转录组与基因组间无显著差异 *indicates there is no difference in significant between transcriptome and genome sequences

表 1 茯苓转录组和基因组序列中SSR统计 Table 1 Description of SSR in transcriptome and genome sequences of P. cocos

在转录组与基因组序列中搜索到的SSR中，分别含有5.40%和4.95%的复合SSR，SPSS χ²检验显示无差异（表 1），说明搜索到的转录组与基因组SSR具有一定的一致性。此外，SSR重复基元（考虑序列互补，且包含复合SSR的重复基元）按核苷酸数分类后，各类型SSR重复基元的基元种类数在茯苓转录组和基因组中亦无显著性差异；但各类型含有的SSR数量及频率却有显著差异（表 2）。在转录组SSR中，核苷酸重复的基元共有241种，少于从基因组数据得到的292种，而且，在转录组SSR中六核苷酸重复基元最多，占35.64%，其次是三核苷酸，占31.04%；而在基因组SSR中则分别是五核苷酸重复基元（32.15%）、六核苷酸基元（25.72%）。转录组SSR及基因组SSR中单核苷酸及四核苷酸重复基元均相对较少，且四核苷酸重复基元的频率无差异（P＞0.05）；单核苷酸重复在基因组SSR只有C/G型，重复长度（21 bp）小于转录组SSR（24 bp）（表 3）。但是，按单一重复基元的数量上看，转录组及基因组SSR均为二核苷酸重复最多，分别为(CG/CG)_n和 (AG/CT)_n。转录组SSR 2～6核苷酸类型重复基元的最高重复数均小于基因组SSR。转录组SSR以单核苷酸C/G重复次数最多，为24次；但以重复14次的ACCACG/CGTGGT六核苷酸的SSR最长，为84 bp。而基因组SSR以AC/GT二核苷酸重复44次为最多，以六核苷酸重复ACCTGC/AGGTGC重复26次，达156 bp最长。转录组SSR与基因组SSR比较，各类型重复基元中数量最多的重复基元只有单核苷酸、三核苷酸及四核苷酸相同，分别为C/G、CCG/CGG、ACGC/CGTG；二核苷酸、五核苷酸及六核苷酸的最多重复基元均不同。此外，在转录组SSR与基因组SSR中，除单核苷酸外，2～6核苷酸的最多重复基元均不是最长的重复基元（表 3）。

表 2(Table 2)

表 2 茯苓SSR重复基元出现频率 Table 2 Occurrence frequency of different SSR motifs of P. cocos 重复基元类型 转录组SSR 基因组SSR 基元种类数 数量 频率/% 基元种类数 数量 频率/% 单核苷酸 2 49 2.23 1 8 0.28 二核苷酸 4 357 16.25 4 576 20.02 三核苷酸 10 682 31.04 10 516 17.94 四核苷酸 15 70 3.19 26 112 3.89 五核苷酸 60 256 11.65 81 925 32.15 六核苷酸 150 783 35.64 170 740 25.72

表 2 茯苓SSR重复基元出现频率 Table 2 Occurrence frequency of different SSR motifs of P. cocos

表 3(Table 3)

表 3 重复基元序列特征 Table 3 Sequence features of different SSR motifs of P. cocos 重复基元 转录组SSR 基因组SSR 平均长 度/bp 最长重复 长度/bp 数量最多的重复基元 （数量，百分比） 平均长 度/bp 最长重复 长度/bp 数量最多的重复基元 （数量，百分比） 单核苷酸 19.76 24 C/G (24, 57.14%) 17.63 21 C/G (8, 100%) 二核苷酸 13.15 34 CG/CG (241, 67.51%) 15.22 88 AG/CT (346, 60.07%) 三核苷酸 17.27 54 CCG/CGG (200, 29.33%) 19.65 90 CCG/CGG (112, 21.71%) 四核苷酸 17.83 28 ACGC/CGTG (18, 25.71%) 18.96 68 ACGC/CGTG (15, 13.39%) 五核苷酸 15.39 25 CCCCG/CGGGG (36, 14.06%) 15.68 35 AATCT/AGATT (274, 29.62%) 六核苷酸 19.21 84 ACGAGT/ACTCGT (60, 7.66%) 22.26 156 ACCAGG/CCTGGT (63, 8.51%)

表 3 重复基元序列特征 Table 3 Sequence features of different SSR motifs of P. cocos

通过MISA搜索，在茯苓转录组序列中确定出1 887条Unigene含有SSR，为了解茯苓中含SSR基因的功能，本研究对含SSR的Unigene进行了GO分类注释。GO将基因功能共分为3个本体，即分子功能（molecular function）、细胞组分（cellular component）、生物进程（biological process），其下又分为了很多亚类，各类间互相关联，从不同角度对基因的功能进行分类注释。通过对含SSR的茯苓Unigene进行GO注释，可以全面描述茯苓中含SSR基因和基因产物的属性。

将搜索到含有SSR的Unigene序列使用BlastX比对到nr蛋白数据库，取比对最高的为序列的注释信息。其中1 561条Unigene注释得到了注释信息，326条无注释结果。再使用Blast2GO软件，进行含SSR的Unigene的GO注释，取得其GO分类号，1 887条Unigene中只有115个Unigene得到了相应的GO分类号，为6.09%，其他1 772个不能成功注释。将含有SSR序列的1 887条Unigene编号及其对应的GO号使用在线工具WEGO（http://wego. genomics.org.cn/cgi-bin/wego/index.pl）进行分类，得到其基因功能分布（图 1）。

1-细胞 2-细胞成分 3-细胞被膜 4-大分子复合物 5-细胞器6-细胞 器组分 7-抗氧化 8-结合活性 9-催化活性 10-分子信息传递 11-结构分子 12-翻译调节 13-转运 14-生物调节 15-细胞进程 16-建立定位 17-定位 18-代谢进程 19-色素沉积 20-对刺激的响应 1～6-细胞组分 7～13-分子功能 14～20-生物进程 1-cell 2-cell part 3-envelope 4-macromolecular complex 5-organelle 6-binding 7-anti-oxidant 8-catalytic 9-hydrolase 10-molecular transducer 11-nucleotide binding 12-structural molecule 13-transferase 14-translation regulator 15-transporter 16-biological regulation 17-cellular metabolic process 18-cellular process 19-localization 20-macromolecule metabolic process 1—6-cell part 7—13-molecular function 14—20-biological process 图 1 茯苓转录组中含SSR的Unigene的GO分类 Fig.1 GO classification of Unigenes containing SSR in transcriptome of P. cocos

结果表明，在有GO注释的115个Unigene中，有107条（93.04%）被注释到分子功能类中，而生物进程及细胞组分类分别有74条（64.35%）和30条（26.09%）。在107条被注释到分子功能类的Unigene中，分别有74条、68条被注释为催化活性（catalytic activity）和结合活性（binding），为有GO注释Unigene的64.35%、59.13%，其中多被注释为转移酶活性（transferase activity）、水解酶活性（hydrolase activity）、核苷酸结合（nucleotidebinding）。而在生物进程类中，以代谢进程（metabolicprocess）及细胞进程（cellular process）下的细胞代谢进程（cellular metabolic process）为主，有43条Unigene，占注释为该类的58.11%。同时，细胞组分类中几乎全注释（28/30，93.33%）为细胞组分（cell part）。综合可知，已被注释出的含有SSR的Unigene主要的功能是与细胞的基础代谢相关的。

由于Unigene的GO注释只有较少比例被注释出来，为了更加全面地了解茯苓转录组序列含有SSR的Unigene的功能，将其注释到KEGG数据库中，分析得到其在茯苓代谢中的通路富集情况。注释KEGG代谢通路时，会给每一个功能的基因给定一个K编号（K numbers），并注释到具有相应归类的代谢通路（pathway）中。

在对茯苓转录组1 887条含SSR的Unigene进行KEGG代谢通路分析时，有1 223条（64.81%）Unigene有注释结果，另外的664条（35.19%）未得到注释。统计被注释的Unigene发现，只得到了412个K编号，即说明Unigene中有许多相互间功能相同，平均达每2.97个Unigene具有相同的功能。当将有K编号注释的Unigene注释到KEGG代谢通路图中时，只有752个Unigene，对应245个K编号被注释到219个通路图（map）中；有471个Unigene，167个K编号未被注释到通路图中。最终，相当于只有39.85%含SSR的Unigene被注释到KEGG代谢通路中。

在对注释到的219个通路图进行分析时，利用KEGG数据库的分类，将其归类到全部7大类代谢通路中，其中被注释到新陈代谢（metabolism）及遗传信息处理（genetic information processing）类的Unigene最多，分别为314、297个，占全部含SSR的Unigene的16.64%及15.94%，占能注释到通路的Unigene的41.76%、39.49%（图 2）。

图 2茯苓转录组中含SSR的Unigene的KEGG代谢通路分类 Fig.2 KEGG pathway classification of Unigenes containing SSR in transcriptome ofP.cocos

对注释到新陈代谢通路类的Unigene作进一步的分类分析，其能注释到13个亚类中的除化学结构转化图（chemical structure transformation maps）类外的其他12个亚类（图 3）。且除总览图（global and overview maps）类外，注释到碳水化合物代谢（carbohydrate metabolism）类通路的Unigene最多，有176个Unigene，占注释到新陈代谢类的56.05%；其次是注释到氨基酸代谢（amino acid metabolism）类、脂类代谢（lipid metabolism）类，这与GO注释得出的基础代谢的结果相一致。

图 3 茯苓转录组中注释到新陈代谢通路的含SSR的Unigene的通路分析 Fig.3 Analysis on Unigenes containing SSR in transcriptome of P.cocos annotated into metabolism pathway

本研究对茯苓菌核、菌丝两个样本高通量测序组装后的Unigene序列进行SSR分布及序列特征分析，从41 327条Unigene中找到2 197个SSR，分布在1 887条Unigene中，包含SSR的序列出现频率为4.57%；比报道的多孔菌目EST-SSR的9.80%出现频率低，但比同时报道的多孔菌科EST-SSR 1.14%频率高。另外，茯苓转录组SSR密度为58.78个/Mb，即平均相隔17.01 kb出现1个SSR序列，比从基因组中找出SSR的密度略高；比报道多孔菌目的149.81个/Mb少，比多孔菌科平均34.81 个/kb多^[13]。这种差异，一方面与物种本身SSR数量差异有关，还与原始序列数量、长度，以及搜索SSR时长度设定最低标准不同有关。本研究与陈媛媛^[16]报道的EST-SSR同时在这3个方面都不同。

同时，由于上述因素的影响，也形成了SSR的序列特征的差异。本研究发现茯苓转录组SSR数量最丰富的是六核苷酸重复基元，其次是三核苷酸基元；这与一般认为的二核苷酸为最、三核苷酸次之有所不同。在茯苓基因组SSR中也同样出现五核苷酸、六核苷酸重复基元较丰富的情况，由于参数设定不同，这与基因组报道的不同^[10]。此外，茯苓单核苷酸、三核苷酸、四核苷酸重复基元数量最多的C/G、CCG/CGG、ACGC/CGTG重复基元与从基因组搜索到的最多的基元相同。从单一重复基元计，转录组、基因组中重复基元数量最多的均为二核苷酸，分别为 (CG/CG)_n、(AG/CT)_n，占总SSR数的10.97%及12.03%。

通过对茯苓转录组中含SSR的Unigene进行GO分类发现其主要归类于生物进程类下的细胞代谢进程、分子功能类下的核苷酸结合及细胞组分类下的细胞组分类。另外，通过KEGG代谢通路注释，Unigene多为新陈代谢及遗传信息处理功能，且在新陈代谢类通路中主要分布于碳水化合物代谢、氨基酸代谢等通路中。综合GO分类及KEGG代谢通路注释结果可推知，茯苓转录组中含SSR的Unigene主要为生物体的基础代谢相关的功能。但在注释GO分类及KEGG代谢通路时出现了多个Unigene共同注释到相同功能上，这种情况的出现除了正常的基因家族等多个基因行使相同功能外，也可能与转录本在加工时的可变剪接、软件拼接错误等有关。因此，对转录组SSR的应用还需要进行相应的引物筛选等工作，同时，可有针对性地选择与一定功能相关的基因作为SSR标记位点，从而利于目标性状的筛选。