白头翁Pulsatilla chinensis (Bge.) Regel属于毛茛科（Ranunculuceae）银莲花Anemone L. 属多年生草本药用植物。在中国大多数省份如四川、安徽、江苏、湖北、河南、甘肃等均有分布^[1]。白头翁具有抗阴道毛滴虫、抗氧化、抗炎、杀虫、抗肿瘤等功效^[2]，具有很高的药用价值^[3]。实验研究发现其提取物也表现出多种药理活性，如白头翁正丁醇提取物对小鼠肝脏的保护作用^[4]及白头翁水溶液的抗炎^[5]、抗心律失常活性^[6]等。但白头翁的抗糖尿病研究还未见报道，本实验研究白头翁水提物（aqueous extract from Pulsatilla chinensis，AEPC）的降血糖活性及其可能作用机制。

白头翁（根部）药材购自北京同仁堂药店，经浙江大学生命科学院傅承新教授鉴定为白头翁Pulsatilla chinensis (Bge.) Regel；链脲佐菌素（STZ，批号79C-0027）、格列本脲（批号024K0701）、尿素、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、总蛋白检测试剂盒均购自Sigma公司；胰岛素检测试剂盒（Crystal Chem公司）。大小鼠繁殖饲料（北京华阜康生物科技有限公司）；聚山梨酯80（上海索莱宝生物科技有限公司）；葡萄糖溶液（天津新郑股份有限公司）。

罗氏GC型血糖检测仪（ROCHE公司）；分光光度计（上海美析仪器有限公司）；酶标仪（上海永创医疗器械有限公司）。

Wistar大鼠，11～12周龄，动物合格证号SCXK （京）-2009-0004，购自北京华阜康生物科技有限公司。新生大鼠为雌雄大鼠性成熟后，配种生育所得。大鼠均在统一的环境中喂养，喂以大鼠繁殖饲料，饲养间配以12 h光照/12 h黑暗循环，温度控制为23～25 ℃，湿度为45%～55%。所有动物实验操作步骤均在国家动物实验标准（GB/T 27416-2014）的指导下完成。

RIN 5F细胞购自美国菌种保藏中心（ATCC）。由含10%胎牛血清的RPIM 1640培养基培养，内含100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素。培养条件为37 ℃、5% CO₂、95%湿度。

取白头翁药材500 g，每次加入2 L的双蒸水，在烧杯中浸泡30 min后，反复煎煮3次，每次20 min。收集煎煮所得药液，浓缩得水提物浸膏，用含1%聚山梨酯-80的水溶解成生药浓度为1 g/mL的AEPC储备液（经HPLC检测，主要含有白头翁皂苷、白头翁素、小檗碱、药根碱、巴马汀、秦皮甲素和秦皮乙素，质量分数均在1%以上），4 ℃保存备用。

OGTT参照文献方法^[7]中的实验步骤进行。取30只雄性Wistar大鼠（11～12周龄），空腹24 h，随机分成5组，对照组，阳性药组，AEPC低、中、高剂量组，每组6只。对照组ig 1% 聚山梨酯-80的水溶液1 mL；AEPC低、中、高剂量组分别ig 10、20、40 mg/kg AEPC；阳性药组ig 0.5 mg/kg格列本脲。给药30 min后，所有大鼠均ig 60% 葡萄糖溶液（3 g/kg）。分别在给糖前1 min及给糖后30、90、150 min尾静脉采血1次，立即通过血糖检测仪检测血糖水平。

具体操作参考文献方法^{[8, 9, 10]}，5日龄的新生Wistar大鼠按体质量ip 80 mg/kg的STZ（溶于0.1 mol/L的柠檬酸缓冲液，pH值为4.5）后放回母鼠身边继续饲养。10周后，空腹12 h尾静脉取血，血糖检测仪检测血糖值。

模型制备后，选取体质量为175～185 g，空腹血糖值在12.7～13.4 mmol/L的雄性大鼠18只，随机分为3组，模型组、AEPC（20 mg/kg）组、阳性药（格列本脲，0.5 mg/kg）组，每组6只，选取6只正常大鼠作为对照组。对照组、模型组每天ig 1 mL 1% 聚山梨酯-80的水溶液，AEPC组、阳性药组均为ig给药，连续给药20 d。于第1天给药前5 min、第5、10、15、20天给药后1 h，尾静脉采集空腹12 h血样，检测血糖值。在第20天测量体质量以后，大鼠通过CO₂麻醉，眼球取血，收集血样进行血清生化指标分析，收集肝组织，称量肝质量，进行肝糖原分析，最后大鼠麻醉处死。血样盛于离心管中，静置37 ℃环境中促其凝固，待血液凝固后，3 000 r/min离心10 min，分离血清。

肝糖原水平通过Caroll等^[11]描述的方法分析，血清丙氨酸转氨酶（ALT）以及天冬氨酸转氨酶（AST）通过Reitman等^[12]的方法检测，碱性磷酸酶（ALP）通过Kind等^[13]描述的方法检测，尿素、TG、TC、HDL-C、总蛋白及胰岛素水平均采用试剂盒方法进行检测。

RIN 5F细胞的胰岛素释放量检测参考Gray等^[14]的方法。RIN 5F细胞铺板到24孔板上，待细胞密度达到1×10⁶/孔开始实验。细胞用KRB缓冲液（pH 7.4，含115 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、1.28 mmol/L CaCl₂、1.2 mmol/L KH₂PO₄、1.2 mmol/L MgSO₄、24 mmol/L NaHCO₃、10 mmol/L HEPES、1 g/L BSA、1.1 mmol/L葡萄糖）洗2次后，在37 ℃孵育40 min后，分别加入AEPC使其终质量浓度为0、5、10、20、40 μg/mL，加入格列本脲使其终质量浓度为0、5、10、15、20 μg/mL，继续孵育20 min。收集上清，保存于−20 ℃。通过试剂盒方法检测胰岛素水平。

实验数据用x±s表示，采用SPSS 19.0软件进行组间方差分析，组间均数比较采用t检验。

10、20、40 mg/kg AEPC均表现出了降糖效果。10 mg/kg AEPC在ig葡萄糖30 min后观测到了轻微的降血糖效果。20、40 mg/kg AEPC在30、90 min后均表现出了明显的降血糖效果。但40 mg/kg AEPC相对于20 mg/kg的降血糖效果并没有明显增加，不存在明显剂量依赖关系。在后续的实验中选取20 mg/kg剂量继续考察。结果见图 1。

与对照组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01, 下同 #P < 0.05 ##P < 0.01 vs control group, same as below 图 1 OGTT检测结果(x±s,n=6) Fig.1 Detection results of OGTT(x±s,n=6)

AEPC 20 mg/kg给药后，观察到了明显的降血糖效果。给药5 d后AEPC组以及阳性药组均观察到了血糖降低，给药10 d和15 d后进一步观察到了血糖的降低。20 d后，给药组的血糖值已经与对照组无明显差别。AEPC与格列本脲表现出了类似的降血糖效果。结果见图 2。

与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01, 下同 *P < 0.05 **P < 0.01 vs model group, same as below 图 2 AEPC对糖尿病大鼠血糖的影响(x±s,n=6) Fig.2 Effect of AEPC on blood glucose of diabetic rats(x±s,n=6)

与对照组比较，模型组大鼠体质量、肝脏质量、以及肝糖原水平均明显下降。AEPC和阳性药组上述指标与对照组比较均无明显改变，结果见表 1。与对照组比较，模型组AST、ALT、ALP、尿素、TG、TC水平上升，HDL-C、总蛋白及血清胰岛素水平下降，AEPC组和阳性药组的上述指标与对照组比较无明显差异。结果见表 2和表 3。

表 1(Table 1)

表 1 各组大鼠的体质量、肝脏质量和肝糖原水平 Table 1 Body weight, liver weight, and liver glycogen values of rats in each group (x±s, n = 6) 组别 剂量/(mg·kg−1) 初始体质量/g 最终体质量/g 肝脏质量/g 肝糖原水平/(mg·g−1) 对照 — 179±5 230±6 8.2±0.5 39.3±3.9 模型 — 180±6 212±7# 6.7±0.6# 16.7±2.0# AEPC 20 182±7 233±7 8.5±0.4 35.3±5.4 格列本脲 0.5 177±5 227±5 8.1±0.4 38.9±2.3

表 1 各组大鼠的体质量、肝脏质量和肝糖原水平 Table 1 Body weight, liver weight, and liver glycogen values of rats in each group

表 2(Table 2)

表 2 各组大鼠的血清生化指标 Table 2 Serum biochemical parameters of rats in each group (x±s, n = 6) 组别 剂量/(mg·kg−1) AST/(U·L−1) ALT/(U·L−1) ALP/(U·L−1) 总蛋白/(g·L−1) 胰岛素/(ng·mL−1) 对照 — 87.6± 8.1 25.6±3.9 9.8±1.9 86.0±9.0 1.43±0.20 模型 — 149.4±10.7# 65.3±6.0# 19.4±2.3# 49.0±5.0# 0.55±0.10# AEPC 20 92.8± 9.9 26.7±3.9 10.5±2.4 77.0±8.0 1.45±0.30 格列本脲 0.5 85.0± 8.3 24.9±2.4 9.9±1.2 83.0±4.0 1.25±0.20

表 2 各组大鼠的血清生化指标 Table 2 Serum biochemical parameters of rats in each group

表 3(Table 3)

表 3 各组大鼠血清尿素和脂质水平 Table 3 Serum urea and lipid levels of rats in each group (x±s, n = 6) 组别 剂量/(mg·kg−1) 尿素/(g·mL−1) TG/(g·mL−1) TC/(g·mL−1) HDL-C/(g·mL−1) 对照 — 181±21 985± 92 821±83 554±61 模型 — 364±32# 1 356±111# 1 295±67# 315±32# AEPC 20 198±23 1 028±102 879±90 512±65 格列本脲 0.5 231±21 1 073±123 850±67 570±76

表 3 各组大鼠血清尿素和脂质水平 Table 3 Serum urea and lipid levels of rats in each group

10、20、40 μg/mL的AEPC呈剂量依赖性地显著增加了RIN 5F细胞的胰岛素释放。而低剂量5 μg/mL对RIN 5F细胞的胰岛素释放无明显影响。同时，阳性药格列本脲也剂量依赖性地促进了RIN 5F细胞的胰岛素释放。说明与格列本脲类似，AEPC能促进RIN 5F细胞的胰岛素释放。结果见图 4。

图 4 细胞胰岛素释放检测结果(x±s, n = 6) Fig.4 Insulin release from RIN 5F cells in vitro(x±s, n = 6)

OGTT结果显示20 mg/kg的AEPC显示了很好的降血糖效果，而高剂量（40 mg/kg）组的降血糖效果与20 mg/kg组比较没有明显增加。所以后续的实验采用20 mg/kg给药。本实验建立了非肥胖的新生儿大鼠2型糖尿病模型，该模型适用于口服降糖药的药效验证。就代谢特征而言，该模型与人2型糖尿病几乎相同，是目前最合适也是最广泛使用的2型糖尿病动物模型^{[8, 10, 15]}。在糖尿病大鼠上，20 mg/kg的AEPC和0.5 mg/kg格列本脲连续给药20 d以后，大鼠的血糖值已经与正常大鼠无明显差异，说明了AEPC对2型糖尿病大鼠具有良好的降血糖效果。此外，AEPC处理后的大鼠的肝脏质量以及肝糖原水平也与正常大鼠无明显差异，该效果有可能是AEPC对脂解作、肝糖分解以及蛋白质水解的调控所引起的。AEPC处理后使模型大鼠AST、ALT、ALP、尿素、TG、TC、HDL-C、总蛋白等代谢指标均恢复了正常，说明AEPC处理后使大鼠的肝功能等恢复了正常。

相对于模型组，AEPC处理组大鼠的血清胰岛素水平明显上升，恢复到了与正常大鼠相当的水平。提示AEPC有可能促进胰岛素分泌。所以，体外考察了AEPC对RIN 5F细胞胰岛素分泌的影响，结果显示AEPC明显地促进了RIN 5F细胞的胰岛素释放。结合AEPC对动物模型的降血糖效果，推测AEPC的降血糖作用可能是通过促进胰岛β细胞分泌胰岛素而实现的。本研究首次报道了AEPC在2型糖尿病模型上的降血糖效果，为白头翁的药理活性研究提供了新的实验证据，但其具体的机制还有待进一步研究。