消炎退热颗粒具有清热解毒、凉血消肿之功效,主要用于风热感冒症见发热、外感热病、上呼吸道感染、热毒壅盛、咽喉肿痛及各种疮疖肿痛等症状。该复方由大青叶、蒲公英、紫花地丁、甘草4味中药组成[1]。由于复方中药水提液是由不同种类中药混合煎制所得,煎药所得水提液中会含有大量的蛋白质及鞣质等成分,而根据相关文献资料研究可知,鞣质又称单宁,是一种多酚中高度聚合化合物,鞣质分子上带有很多强还原性的酚羟基,极易被氧化,如遇多糖、生物碱、蛋白质等物质,会与其生成氢键而结合成不溶于水的沉淀,从而使中药水提液药液浑浊不稳定,蛋白质在药液中也容易腐败变质,影响中药的药性和储藏[2]。
目前,消炎退热颗粒的生产工艺仍是水提醇沉法[3],但是经过实验研究表明,对中药水提液进行水提醇沉来分离除杂会造成较多有效成分的流失,在除杂的同时一并去除了很多高分子化合物以及人体新陈代谢所需的微量元素,并且水作为溶剂,溶解范围广,以水为溶剂提取中药,会提取出很多无用的成分,从而使得同等剂量下的中药中的有效成分含量降低,药效下降。加之水提醇沉工艺乙醇用量大,虽可回收乙醇但回收率低,药液生产周期长[4]。现代中药生产正在探索新的方法来替代水提醇沉工艺。天然高分子絮凝剂壳聚糖作为目前发现的唯一1种天然碱性多糖,应用到中药水提液的分离除杂方面,主要有以下几点优点:(1)壳聚糖的安全性好,生物相容性好,易被生物降解,且壳聚糖降解后无毒副作用;(2)壳聚糖具有增强免疫、调血脂和降血压的作用;(3)壳聚糖及其衍生物对重金属离子的螯合性,具有抗菌抗癌,促进伤口愈合等作用[1, 5, 6, 7, 8]。并且由相关资料了解可知,中药水提液中富含大量的糖类、无机盐等较强吸潮性的成分,特别是经过醇沉工艺后的浸膏更加容易吸潮,使得在生产固体或颗粒中药制剂时对制剂成型有所影响,而采用絮凝工艺来除杂净化中药提取液,能很大程度减少此类成分的量,净化后的水提液易干燥,不容易吸潮,对后续固体制剂的加工会有比较好的稳定性[7]。
基于壳聚糖絮凝剂在絮凝过程中的种种优点以及经过后续的絮凝剂筛选实验的进一步确定,本实验采用壳聚糖作为絮凝剂对消炎退热颗粒中药水提液进行絮凝除杂净化研究,以有效成分秦皮乙素保留率,杂质成分鞣质和蛋白质的去除率以及除杂净化后静置的上清液浊度作为主要考察指标,研究了壳聚糖用于此种复方中药的絮凝除杂效果,确定出壳聚糖絮凝剂对此种复方中药的最佳絮凝工艺。
1 仪器与材料WH-S智能型混凝式搅拌仪,天津市威华仪器设备有限公司;722紫外/可见分光光度计,上海菁华仪器有限公司;分析天平TD12001,奥豪斯国际贸易有限公司;SC-15高温循环水浴箱,上海比朗仪器有限公司;Agilent1200高效液相色谱仪,安捷伦科技有限公司;WGZ-100散射式光电浊度仪,上海珊科学仪器厂;DS-3510DT超声波振荡器,上海生析超声仪器有限公司。
干药材大青叶(批号140401)为十字花科大青属植物菘蓝Isatis indigotica Fort. 的干燥叶、蒲公英(批号140801)为菊科蒲公英属植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand. -Mazz. 的干燥全草、紫花地丁(批号141001)为堇菜科植物紫花地丁Viola yedoensis Makino的干燥全草、甘草(批号140201)为豆科甘草属植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch. 的干燥根和根茎,均购自河北安国市中天中药饮片有限公司,经安国市中天中药饮片公司药剂师焦玉军鉴定均合格。
壳聚糖,脱乙酰度90.45%,浙江金壳药业有限公司;秦皮乙素对照品(批号BW5140-20130416,质量分数≥98%)、蛋白质对照品(批号BW3627- 20141230,质量分数≥98%),北京北化恒信生物技术有限公司;没食子酸对照品(批号110831- 201204,质量分数≥99%),天津市大茂化学试剂厂。实验过程中所用的水均为去离子水,甲醇、磷酸为色谱纯,其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果 2.1 消炎退热颗粒原药水提液的制备根据《中国药典》2010年版消炎退热颗粒处方中的比例[1](大青叶-蒲公英-紫花地丁-甘草8∶8∶3∶1)分别称取大青叶120 g、蒲公英120 g、紫花地丁45 g、甘草15 g,添加去离子水煎煮2次。第1次添加10倍的去离子水即3 000 mL,煎煮1 h,双层纱布滤过药液;然后再添加8倍的去离子水即2 400 mL继续煎煮1 h,双层纱布滤过;将2次所得药液合并并定容至3 000 mL,得到质量浓度为0.1 g/L的药液,按药液体积的0.3%添加苯甲酸钠防腐剂9 g,并在20 ℃以下储藏,备用。
2.2 絮凝剂的制备准备1个500 mL量瓶,向其中添加精确称取的5 g壳聚糖,并向其中添加质量分数为1%的冰醋酸溶液5mL,然后用去离子水定容至500 mL,溶胀24 h,备用。
2.3 有效成分秦皮乙素的测定根据《中国药典》2010年版的规定,消炎退热颗粒每袋含紫花地丁以秦皮乙素(C9H6O4)计,不得少于0.3 mg[1]。因此秦皮乙素是衡量消炎退热颗粒药效的1个重要指标,通过HPLC方法对消炎退热颗粒水提液中秦皮乙素的量进行测定。
2.3.1 色谱条件C18色谱柱(200 mm×4.6 mm,10μm),以甲醇-水-冰醋酸(20∶80∶0.5)为流动相,体积流量为1.0 mL/min,检测波长为353 nm,柱温为室温,理论板数按秦皮乙素峰值计算应不低于3 000[1]。
2.3.2 对照品溶液的制备及标准曲线的绘制精密称取质量分数为98%秦皮乙素对照品17.9 mg,置于100 mL量瓶中,添加甲醇(色谱纯)至刻度线,配得对照品溶液的质量浓度为175.42μg/mL,分别取1、2、3、4、5、6 mL对照品溶液并分别用甲醇定容至10 mL,用0.45 μm微孔滤膜滤过,然后超声震荡30 min,分别进样10 μL不同质量浓度的秦皮乙素对照品溶液,测定峰面积,记录相关数据和色谱图,以峰面积对秦皮乙素进样量进行线性回归,得回归方程为Y=40.838 11 X-28.503 57,r2=0.999 7,秦皮乙素在17.542~105.252 μg/mL线性关系良好。
2.3.3 供试品溶液的制备精密量取消炎退热颗粒原药水提液1 mL于10 mL试管,用甲醇定容至10 mL,然后用0.45 μm微孔滤膜滤过,然后超声震荡30 min。
2.3.4 样品测定分别精密量取上述配制的对照品和供试品溶液各10 μL,注入高效液相色谱仪中测定峰面积,然后从秦皮乙素标准曲线中计算秦皮乙素的量,按以下公式可以计算出秦皮乙素保留率。
2.4 蛋白质及鞣质量的测定本研究中采用《中国药典》二部附录VII M考马斯亮蓝法(Bradford法)[2]测定蛋白质的量,采用考马斯亮蓝G-250试剂为蛋白质染色,以事先配好的空白对照品为对照,用紫外/可见光光度计在595nm波长处测定吸光度(A)值,然后通过比对蛋白质的量的标准曲线来测定中药水提液中蛋白质的量。蛋白质的去除率可按以下公式进行计算。
通过对蛋白质标准品的测定,以A值对蛋白质进样量进行线性回归,回归方程为Y=0.003 58 X+0.006 72,r2=0.9958,蛋白质在10~80 μg/mL线性关系良好。
在本研究中采用《中国药典》2010年版附录XB鞣质定量测定法规定的磷钼钨酸比色法测定[1],以磷钼钨酸为显色剂,以干酪素作为吸附剂,以没食子酸为对照品,用紫外/可见光光度计在760nm波长处以空白为对照测定A值,然后从鞣质标准曲线上反读出鞣质的量。鞣质的去除率可按以下公式进行计算。
通过对鞣质标准品的测定,以A值对没食子酸进样量进行线性回归,回归方程为Y=4.441 23 X+0.055 01,r2=0.994 0,鞣质在0.025~0.25 mg/mL线性关系良好。
2.5 浊度的测量采用散射式光电浊度仪对絮凝后消炎退热颗粒原药水提液的上清液浊度进行测量。
2.6 壳聚糖用于消炎退热颗粒原药水提液絮凝除杂工艺的研究中药原药水提液絮凝除杂净化的效果主要取决于絮凝剂种类及用量、絮凝反应温度、絮凝搅拌速度及时间。首先对目前8种常用的中药絮凝剂(壳聚糖、壳聚糖季铵盐、壳聚糖盐酸盐、羧甲基壳聚糖、单宁、明胶、卡拉胶、海藻酸钠)进行了絮凝剂的初选实验。从实验现象的观察来看,壳聚糖、壳聚糖季铵盐以及壳聚糖盐酸盐较其他絮凝剂均表现出了絮凝反应后产生大量细小的絮体,药液分层明显,上清液颜色透亮,澄清度较高等优点,再通过对其上清液中有效成分及杂质还有浊度的测定比较后,尤以壳聚糖以较高的有效成分保留率及较高的杂质去除率及接近纯水的浊度值(1.0 NTU)较为突出,因此本实验采用壳聚糖对消炎退热颗粒原药水提液进行絮凝除杂净化。
2.6.1 絮凝剂用量对中药原药水提液絮凝效果的影响研究按之前的步骤制备消炎退热颗粒原药水提液,通过查阅冯颖等[9]以及刘杰等[10]对絮凝剂用于中药水提液絮凝除杂研究的文献记载,在絮凝剂用量、絮凝温度、搅拌速度及搅拌时间的可选范围内,按表 1设计絮凝剂用量实验,絮凝温度初选30 ℃、快搅速度450 r/min、快搅时间2 min、慢搅速度50 r/min、慢搅时间10 min。由表 1中的数据可以看出,当絮凝剂添加量很少的时候,有效成分的保留率很高,蛋白质及鞣质2种杂质的去除率很低,上清液的浊度值很高;随着壳聚糖絮凝剂的添加量的增多,上清液的有效成分秦皮乙素保留率基本呈现出逐渐减小的趋势,而蛋白质和鞣质的去除率呈现出先增大后减小的趋势,上清液的浊度值呈现出先迅速减小,然后逐步增大的趋势。
由于壳聚糖是一种天然碱性多糖,呈弱碱性,其分子链上含有大量的游离羟基及氨基活性官能团,而在本实验中配制壳聚糖絮凝剂时添加1%冰醋酸溶液,其分子链上的活性官能团氨基会被质子化为-NH3+,使得壳聚糖成为一种可溶性的阳离子有机聚电解质[10, 11]。因此向原药水提液中添加壳聚糖絮凝剂会与药液中带负电荷的杂质分子发生电中和反应[3],同时壳聚糖的线状分子与杂质微粒间实现多点架桥吸附作用[11],从而使得杂质分子絮凝成大絮团而依靠重力沉降下来,从而起到絮凝澄清的效果。最开始絮凝剂的添加量很少,絮凝剂分子与杂质颗粒的碰撞结合几率很小,因此药液中的大部分悬浮微粒及胶体颗粒不能有效的电中和及吸附架桥反应,药液整体呈现出较浑浊的状态;随着絮凝剂用量的增加,大量絮凝剂分子同杂质分子进行电中和和网捕卷扫吸附结合,大块絮团开始明显的产生,通过重力沉降使药液的澄清度明显提高;但随着絮凝剂用量的过度添加,药液的澄清度大幅度下降。综合实验研究可以得出,壳聚糖用于消炎退热颗粒的原药水提液的最佳絮凝剂添加量为0.75~1.50 g/L,其中1.25 g/L的絮凝剂添加量效果比较好。
2.6.2 絮凝温度对絮凝效果的影响在确定了絮凝剂添加量为1.25 g/L的情况下,进一步考察温度对原药水提液絮凝效果的影响。按相同的步骤制备消炎退热颗粒原药水提液,絮凝剂添加量选择1.25 g/L,按表 2设计絮凝温度实验,快搅速度450 r/min,快搅时间2 min,慢搅速度50 r/min,慢搅时间10 min。由表 2中的数据可以看出,随着温度的逐渐升高,有效成分的保留率基本没有太大的波动变化,蛋白质及鞣质的去除率有逐渐升高的趋势,药液的浊度值逐渐降低,药液澄清度有所提高;但是随着絮凝温度的过度升高,药液的有效成分秦皮乙素保留率总体上有所提高,蛋白质及鞣质的去除率有比较明显的下降,药液的浊度值也大幅提升,药液澄清度明显下降。
随着温度的增加,颗粒间的布朗运动逐渐变得剧烈起来,絮凝剂分子与药液中的颗粒间碰撞的几率变大,使得颗粒间发生电中和及吸附架桥的作用增强,因此蛋白质及鞣质的去除率得以提升;同时随着温度的升高,药液的黏度逐渐降低,颗粒沉降所受的阻力逐渐减小,颗粒相互吸附后能迅速沉降,因此能很明显地看到药液的澄清度大幅提升。但是过高的温度会使得絮凝剂分子失活老化甚至变性丧失絮凝效果,从而使得絮凝过程无法继续进行。同时由于高温使得药液的黏度变得很低,降低了絮体与颗粒的碰撞几率。因此,综合比较药液中有效成分的保留率及杂质的去除率以及药液浊度后,壳聚糖用于消炎退热颗粒原药水提液的最佳絮凝温度为30~45 ℃,其中40 ℃的絮凝温度效果比较好。
2.6.3 快搅速度对絮凝效果的影响由于絮凝效果的好坏直接取决于絮凝剂分子与水提液中杂质分子之间的吸附架桥网捕卷扫的程度,而良好的水利条件对絮凝反应过程中吸附架桥网捕卷扫反应起着至关重要的作用。在中药水提液絮凝除杂的过程中,慢搅过程主要是使得已产生的絮体稳定沉降的过程,快搅过程的水利条件相较于慢搅过程对整个絮凝反应的效果起着更加至关重要的作用。因此在确定了絮凝剂添加量为1.25 g/L,絮凝反应的温度为40 ℃的情况下,进一步考察快搅速度对原药水提液絮凝效果的影响。按相同的步骤制备消炎退热颗粒原药水提液,絮凝剂添加量选择1.25 g/L,絮凝温度为40 ℃,按表 3设计絮凝快搅速度实验,快搅时间2 min,慢搅速度50 r/min,慢搅时间10 min。
由表 3中的数据可以看出,随着快搅速度的逐渐升高,有效成分秦皮乙素的保留率呈现比较明显的降低趋势,蛋白质及鞣质的去除率呈现先逐渐升高再降低的趋势,药液的浊度值呈现先降低后升高,药液由浑浊到澄清再到浑浊。
由实验数据分析可知,随着快搅速度的提高,絮凝剂的分散会比较均匀,比较有利于强度大体相同的絮体的产生,絮凝效果比较好;当快搅速度过快的时候,刚刚产生的不稳定絮体在高速叶片产生的强力剪切力作用下会被再次撕裂,从而变成细小的悬浮絮体,这些絮体难以克服自身的重力而沉降,从而导致在搅拌结束后药液静置数小时都不能使得药液上清液澄清。综合比较药液中有效成分的保留率及杂质的去除率以及药液浊度后,壳聚糖用于消炎退热颗粒的原药水提液的最佳絮凝快搅速度为350~450 r/min,其中450 r/min的快搅速度絮凝效果比较好。
2.6.4 快搅时间对絮凝效果的影响快搅过程的水利条件对整个絮凝过程的絮凝效果好坏有着至关重要的影响,而水利条件除了搅拌速度以外,搅拌的时间也是很重要的一个因素。因此在确定了絮凝剂添加量为1.25 g/L,絮凝反应的温度为40 ℃,快搅速度为450 r/min的情况下,进一步考察快搅时间对原药水提液絮凝效果的影响。按相同的步骤制备消炎退热颗粒原药水提液,絮凝剂添加量选择1.25 g/L,絮凝温度为40 ℃,快搅速度为450 r/min,按表 4设计絮凝快搅时间实验,慢搅速度50 r/min,慢搅时间10 min。
由表 4中的数据可以看出,随着快搅时间的逐渐升高,有效成分的保留率呈现逐渐降低的趋势之后随着搅拌时间的延长,形成的絮体在外力的作用下再次破碎,使得药液中的有效成分有略微的提升,蛋白质及鞣质的去除率呈现先升高再降低的趋势,药液的浊度值在快搅时间为2 min的时候呈现明显的降低趋势,药液澄清度大幅提高,之后的变化不是很明显。
由实验数据分析可知,快搅时间过短或过长都会对絮凝反应的效果有很明显的影响。快搅搅拌时间太短,不利于絮凝剂在药液当中的分散,使得絮凝反应进行的不充分,絮凝效果不理想;快搅搅拌时间过长,刚刚形成的不稳定絮体在长时间的搅拌桨剪切力作用下会被扯裂破碎,使得絮凝效果变差。因此综合比较药液中有效成分的保留率及杂质的去除率以及药液浊度后,壳聚糖用于消炎退热颗粒的原药水提液的最佳絮凝快搅时间为1~3 min,其中2 min的快搅时间絮凝效果比较好。
2.6.5 正交试验通过之前实验研究的几个对絮凝过程影响产生比较关键性作用的因素后,确定出絮凝剂用量(A)、絮凝温度(B)、快搅速度(C)、快搅时间(D)4个因素是影响壳聚糖絮凝效果的主要因素,然后进行正交试验来确定这4个因素的最优组合。实验过程中慢搅速度均设定为50 r/min,慢搅时间均设定为10 min。设计正交试验,结果见表 5~7。
综合A、B、C、D 4个因素对絮凝实验效果的影响,正交试验的第8组絮凝参数,即壳聚糖添加量为1.25 g/L,絮凝反应温度为40 ℃,快搅速度为350 r/min,快搅时间为3 min,慢搅速度为50 r/min,慢搅时间为10 min时絮凝效果最好。在该条件下处理后的药液秦皮乙素保留率高达88.92%,蛋白质去除率高达62.96%,鞣质的去除率高达67.19%,药液的浊度为5.0 NTU。在此最佳絮凝工艺参数下,分别在相同的实验条件下进行了3个批次的重复性验证实验,结果见表 8。
通过絮凝工艺对消炎退热颗粒原药水提液除杂纯化的研究中发现,采用壳聚糖作为絮凝剂在絮凝剂添加量为1.25 g/L,絮凝温度为40 ℃,快搅速度为350 r/min,快搅时间为3 min的絮凝条件下,分离纯化后的药液中有效成分秦皮乙素的保留率为88.92%,蛋白质和鞣质的去除率分别为62.96%和67.19%,絮凝后药液静置24 h后浊度为5.0 NTU,在药液有效成分保留率较高的情况下,较大程度的去除了影响药液品质的杂质成分,药液的澄清度以及稳定性有明显的提升。因此采用壳聚糖作为絮凝剂分离纯化消炎退热颗粒原药水提液具有较好效果,处理后的药液中有效成分保留率、杂质成分去除率以及药液澄清度均表现出较佳的除杂效果,提高了原药液的利用率。
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