2015, Vol. 46
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.22.014 |
2. 南京中医药大学 图书馆, 江苏 南京 210023
2. Library of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China
方剂是中医临床用药的主要形式，具有多成分、多靶点、多通路的特征，传统基于“疾病-单基因-单靶点”的线性研究模式已远远不能适应中医药发展的需要。网络药理学是在系统生物学、多向药理学及多种组学技术的基础上建立和发展起来的，与中药方剂注重多组分配伍、多靶点及系统调控思想十分吻合，日益成为中医药领域新的研究模式[1, 2, 3, 4]。
支气管哮喘（简称哮喘）是由多种细胞包括气道炎性细胞（如嗜酸粒细胞、T细胞、肥大细胞、中性粒细胞）、结构细胞（如平滑肌细胞、成纤维细胞、上皮细胞等）和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病，其病理基础是伴有细胞因子产生异常及气道变态反应性炎症发生的一种免疫失衡性疾病。笔者搜集了近20年文献中治疗哮喘疗效确切且有效应指标的方剂，发现三拗汤组方中的麻黄、杏仁、甘草使用频率较高，因此构建其主要功效物质靶点网络模型，分析三拗汤多成分、多靶点与多通路间复杂网状关系，为哮喘方剂配伍规律及作用机制研究提供依据。
1 哮喘方剂搜集和整理 1.1 数据来源检索中国知网（CNKI）、维普、万方、中国生物医学文献服务系统等数据库，发表时间界定为1994年12月31日—2014年12月31日，主题词为哮喘。
1.2 纳入标准选择治疗哮喘发作期属寒哮和热哮类型，有完整的药物组成及剂量，检测了效应指标的方剂。
1.3 排除标准无药物组成或药物组成不完整、无效应指标检测、治疗缓解期等其他类型哮喘的方剂不予收录（2002年《中药新治疗哮病的临床指导原则》将发作期分寒哮、热哮、风哮、虚哮；而缓解期则分肺气亏虚、脾气亏虚和肾气亏虚型）。
1.4 药名规范处理所有方剂根据《中华本草》对药名进行规范处理，如草麻黄、华麻黄统一为麻黄，苦杏仁统一为杏仁，国老、甜草统一为甘草，小辛、细草、独叶草统一为细辛，蚯蚓、曲蟮统一为地龙，白姜、均姜、干生姜统一为干姜，甜葶苈、苦葶苈统一为葶苈子，大半夏统一为半夏等。
1.5 统计方法本研究用药物支持度揭示方剂中频繁出现的药物，定义最小支持度为0.010 0，计算药物的支持度（药物出现的频数/所有方的总频数）。
1.6 结果共搜集哮喘方390首，其中寒哮方187首，热哮方203首；出现单味药253种。取支持度较高（支持度前10位）的代表性药物进行对比，见表 1。
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表 1 高频药物支持度 Table 1 Support of high-frequency drugs |
由表 1可知，所有哮喘方以及寒、热哮喘方中，支持度最高的药物均为麻黄。哮喘方中支持度均高于0.500 0的共同药物为麻黄、杏仁、甘草。寒哮方中细辛、干姜，热哮方中黄芩、桑白皮支持度高于0.500 0。这与前期研究结果一致，即325首古今哮喘方剂中支持度较高的药物为麻黄、杏仁、甘草[5]。麻黄、杏仁、甘草为《太平惠民和剂局方•卷二》中三拗汤组成，“治感冒风邪，鼻塞声重，语音不出；或伤风伤冷，头痛目眩，四肢拘倦，咳嗽多痰，胸满气短”[6]。方以麻黄为君，宣肺平喘、发散风寒；杏仁为臣，味苦泄降、性温发散，既有下气定喘止咳之功，又有疏散肺经风邪、宣滞化痰之能；麻杏配伍，一宣一降，使肺经气机调畅；甘草调和麻杏宣降，且“补中有散”。历代医家在三拗汤组方基础上衍变出多种三拗汤类方，现代临床以三拗汤为主方，治疗各种原因引起的哮喘及上呼吸道疾病均取得良好且稳定的疗效。
2 三拗汤多靶点调控网络构建 2.1 数据准备与方法本研究以《中国药典》《中华本草》《中药大辞典》等书籍为基础，筛选三拗汤活性功效成分，应用ChemBioDraw软件绘制各成分的分子结构，通过PharmMapper数据库进行靶标预测（http:// 59.78.96.61/pharmmapper/）。由于检索到的药物靶标存在命名不规范等问题，因此使用Uniprot数据库中UniProtKB搜索功能（http://www.uniprot.org/），将检索到的所有与人类相关的靶点蛋白校正为其官方名称[7]。获取的与功效成分相关的蛋白信息在博奥数据库MAS3.0系统中进行通路预测（http://bioinfo.capitalbio.com/mas3/），分析和筛选与哮喘相关通路[8, 9]，建立成分-靶点-通路数据库，采用Cytoscape软件绘制网络药理图。
2.2 结果 2.2.1 筛选功效成分、靶点和通路麻黄、杏仁、甘草具有抗炎、调节免疫、平喘、镇咳、祛痰、抗氧化、调节离子通道作用的活性成分48个，见表 2。
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表 2 麻黄、杏仁、甘草主要活性成分 Table 2 Main active ingredients from Ephedra sinica, Armeniacae Amarum Semen, and Glycyrrhiza uralensis |
药材 为了进一步筛选与哮喘密切相关的功效成分，通过网络模拟、参考文献报道以及课题组前期研究[10, 11, 12, 13, 14]确定了其中的11个成分为主要功效成分：麻黄碱（ephedrine）、伪麻黄碱（pseudoephedrine）、甲基麻黄碱（methylephedrine）、2,3,5,6-四甲基吡嗪2,3,5,6-tetramethylpyrazine、α-松油醇（α-terpineol）、苦杏仁苷（amygdalin）、亚油酸（oleic acid）、甘草酸（gycyrrhizic acid）、甘草苷（liquiritin）、异甘草苷（isoliquiritin）和刺芒柄花素（formononetin）。
2.2.2 三拗汤功效成分靶点通路的注释和分析三拗汤11个功效成分作用于76个靶点。频次较高的靶点：双重特异性丝裂原活化蛋白激酶激酶1（35次）、丝裂原活化蛋白激酶1（27次）、丝裂原活化蛋白激酶14（23次）、丝裂原活化蛋白激酶10（17次）、RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（12次）、GTP酶（12次）、Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物1（11次）、肝细胞生长因子受体（11次），见表 3。
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表 3 三拗汤功效成分的部分靶点信息 Table 3 Part of targets information from functional components of San-ao Decoction |
三拗汤主要功效成分涉及46条通路，从共同通路探析药物之间的配伍关系，从特有通路考察其特异性，见表 4。三药共同通路14条，其中与免疫系统相关通路4条：Fc epsilon RI信号通路、T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路、抗原加工和呈递；与信号传导相关通路3条：ErbB信号通路、MAPK信号通路、VEGF信号通路；与内分泌系统相关通路3条：PPAR信号通路、P53信号通路、外源性物质的细胞色素P450代谢；与细胞过程相关通路：Focal adhesion；与能量代谢相关通路：硫代谢；氨基酸代谢相关通路：谷胱甘肽代谢；与疾病相关通路：小细胞肺癌。
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表 4 三拗汤功效成分-靶点-通路 Table 4 Components-targets-pathways of functional components of San-ao Decoction |
除三药共有通路外，麻黄和杏仁存在共同通路3条，与氨基酸代谢相关通路：含硒氨基酸代谢；与碳水化合物代谢相关通路：丙酮酸代谢；与外源性化学物质的生物降解相关通路：香叶醇降解。
麻黄和甘草存在共同通路4条，与内分泌系统相关通路：雄激素和雌激素代谢；与细胞过程相关通路：细胞周期；与免疫系统相关通路：白细胞跨内皮迁移；与信号转导相关通路：细胞因子及其受体的相互作用。
杏仁和甘草存在共同通路12条，与细胞过程相关通路4条：Focal adhesion、细胞凋亡、长时程增强、调节肌动蛋白细胞骨架；与免疫系统相关通路3条：Toll样受体信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒作用、原发性免疫缺陷；与信号转导相关通路2条：mTOR信号通路、Wnt信号通路；与疾病相关通路：非小细胞肺癌；与脂质代谢相关通路：花生四烯酸代谢；与氨基酸代谢相关通路：酪氨酸代谢。
麻黄特有通路3条，与免疫系统相关通路：Notch信号通路；与信号传导相关通路：神经活性配体-受体相互作用；与脂质代谢相关通路：α-亚麻酸代谢。杏仁特有通路4条，与细胞过程相关通路：Gap junction；与信号传导相关通路：轴突导向；与碳水化合物代谢相关通路：糖酵解/糖异生；与免疫系统相关通路：视黄醇（维生素A）代谢；甘草特有通路6条，与信号传导相关通路：TGF-β信号通路、磷酸肌醇代谢；与免疫系统相关通路：JAK-STAT信号通路；与内分泌系统相关通路：促性腺激素释放激素信号转导通路、肾素-血管紧张素系统；与脂质代谢相关通路：亚油酸代谢。
采用Cytoscape软件建立三拗汤功效成分-靶点-通路网络模型，11个成分与多靶点及多条通路间的关系见图 1。
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六边形-药物成分 长方形-靶点 椭图形-通路 hexagon-components rectangle-targets oval-pathways 图 1 三拗汤功效成分-靶点-通路网络图Fig.1 Components-targets-pathways network model of functional components of San-ao Decoction |
网络药理学的概念首次由英国著名药理学家Hopkins于2007年提出，是基于系统生物学，通过分析生物系统多靶点网络，选取特定信号节点进行多靶点药物分子设计及药理及毒理研究的新学科[15]。疾病发生的分子机制是细胞内调控网络发生异常，特别是复杂慢性疾病往往是由多基因、多功能蛋白相互作用紊乱而形成的疾病网络。网络药理学的突出特点是从系统生物学和生物网络平衡的角度阐释疾病的发生发展过程、从改善或恢复生物网络平衡的整体观角度认识药物与机体的相互作用并指导新药发现，强调对多信号通路的调节，以达到减毒增效的目的[16]。
本研究经文献分析得出三拗汤药物组成麻黄、杏仁、甘草在哮喘方剂中支持度较高。通过对三拗汤多成分-靶点-通路网络分析发现，其主要功效成分均作用于多个靶点，呈现出多成分、多靶点、整合调节的作用特点。在此基础上，三拗汤各功效成分调控不同的通路群，各通路群又通过共有靶点蛋白连接，显示出不同成分之间的多靶点协同作用。三味药物既有共同的作用靶点及通路，又各有侧重，体现了其多成分、多靶点、多途径作用模式。
宣肺平喘是三拗汤的主要功效[17, 18]，从网络分析结果来看，该功效涉及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、GTP酶、Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物1、肝细胞生长因子受体等多个作用靶点。频数较高的MAPK是一组能被不同的细胞外刺激，如细胞因子、神经递质、激素、细胞应激及细胞黏附等激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。MAPK级联激活是多种信号通路的中心，可调节细胞的生长、分化、对环境的应激适应、炎症反应等多种重要的细胞生理病理过程。
三拗汤药物配伍作用于免疫-内分泌-信号传导-细胞过程中的多条代谢通路。麻黄与杏仁配伍偏重与氨基酸、碳水化合物等代谢通路有关，表明两者可能通过调控物质代谢发挥君臣相使的作用。甘草与麻黄、杏仁配伍后作用范围扩大，与麻黄配伍侧重于内分泌、免疫和信号转导通路，与杏仁配伍侧重于细胞过程、免疫、信号转导、物质代谢等通路，表明甘草能协君药麻黄、臣药杏仁发挥佐使作用，三药相配，共奏疏风宣肺、止咳平喘之功。
本研究通过建立三拗汤多靶点通路网络模型，探讨了其组成药物功效成分与作用靶点蛋白、通路的相关性，从网络药理学角度阐述了它们之间的配伍关系，为深入研究哮喘方剂的作用机制提供参考。
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