中草药  2015, Vol. 46 Issue (22): 3357-3363
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引用本文doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.22.012
刘廷, 狄留庆, 彭琳秀, 康安, 李俊松, 赵晓莉. UPLC-MS/MS同时测定双黄连口服液中17种有效成分[J]. 中草药, 2015, 46(22): 3357-3363.
LIU Ting, DI Liu-qing, PENG Lin-xiu, KANG An, LI Jun-song, ZHAO Xiao-li. Simultaneous determination of 17 major components of Shuang-Huang-Lian Oral Liquid by UPLC-MS/MS[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2015, 46(22): 3357-3363.
UPLC-MS/MS同时测定双黄连口服液中17种有效成分
刘廷1, 狄留庆1,2 , 彭琳秀1, 康安1,2, 李俊松1,2, 赵晓莉1,2    
1. 南京中医药大学药学院, 江苏 南京 210023;
2. 江苏省中药高效给药系统工程技术研究中心, 江苏 南京 210023
收稿日期: 2015-07-04;
基金项目: 江苏省“333高层次人才培养工程”资助项目(BRA2013201);江苏高校优势学科建设工程资助项目(ysxk-2010)
作者简介: 刘廷(1990-),男,硕士在读。E-mail:liuting19900902@163.com
通讯作者: 狄留庆(1964-),教授,博士生导师。Tel:(025)85811230 E-mail:diliuqing928@163.com
摘要: 目的 建立超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定双黄连口服液中17种成分(新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、异连翘酯苷、连翘酯苷A、连翘苷、芦丁、黄芩素、黄芩苷、野黄芩苷、汉黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖苷、汉黄芩素、千层纸素A)的分析方法。方法 采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),以乙腈-甲醇(4:1)-0.4%甲酸水为流动相,梯度洗脱,体积流量为0.4 mL/min,柱温40 ℃,采用电喷雾电离源(ESI),多反应离子监测(MRM)扫描方式进行检测,分析时间为7 min。结果 所测17种有效成分在测定质量浓度范围内线性关系良好,r2均大于0.990 1,实验精密度、准确度和稳定性良好,平均加样回收率为95.81%～102.42%,所测5批样品中17种成分定量范围依次为新绿原酸782.68～1 034.27 μg/mL、绿原酸786.35～1 103.77 μg/mL、隐绿原酸898.00～1 238.94 μg/mL、咖啡酸82.85～115.17 μg/mL、3,5-二咖啡酰奎宁酸226.02～461.63 μg/mL、3,4-二咖啡酰奎宁酸191.59～404.21 μg/mL、异连翘酯苷243.62～298.51 μg/mL、连翘酯苷A 978.43～1 487.37 μg/mL、连翘苷351.97～435.82 μg/mL、芦丁41.19～75.65 μg/mL、黄芩素40.28～73.73 μg/mL、黄芩苷10 080.54～10 820.35 μg/mL、野黄芩苷40.88～50.51 μg/mL、汉黄芩苷187.73～204.85 μg/mL、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖苷144.92～335.08 μg/mL、汉黄芩素9.30～25.58 μg/mL、千层纸素A 7.51～16.58 μg/mL。结论 方法简单、快速、准确度及灵敏度高、专属性好,可用于双黄连口服液中3大类17个主要成分的快速定量测定。
关键词: 超高效液相色谱-串联质谱     双黄连口服液     新绿原酸     绿原酸     隐绿原酸     咖啡酸     3,5-二咖啡酰奎宁酸     3,4-二咖啡酰奎宁酸     异连翘酯苷     连翘酯苷A     连翘苷     芦丁     黄芩素     黄芩苷     野黄芩苷     汉黄芩苷     千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖苷     汉黄芩素     千层纸素A    
Simultaneous determination of 17 major components of Shuang-Huang-Lian Oral Liquid by UPLC-MS/MS
LIU Ting1, DI Liu-qing1,2, PENG Lin-xiu1, KANG An1,2, LI Jun-song1,2, ZHAO Xiao-li1,2    
1. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China;
2. Jiangsu Provincial TCM Engineering Technology Research Center of High Efficient Drug Delivery System (DDS), Nanjing 210023, China
Abstract: Objective To establish a UPLC-MS/MS method for simultaneous determination of 17 bioactive compounds in Shuang-Huang-Lian Oral Liquid. Methods The separation was performed on an Acquity UPLC HSS T3 C18 column (100 mm ×2.1 mm, 1.7 μm) and the flow rate was set at 0.4 mL/min with acetonitrile/methanol (4:1)-0.4% formic acid as the mobile phase. The column temperature was 40 ℃ and only 7 min was needed for separating the five pairs of isomers. The detection was performed on a triple quadrupole tandem mass spectrometer by multiple reaction monitoring (MRM) via electrospray ionization (ESI) source with positive and negative modes. Results All calibration curves had good linearity (r2 >0.990 1). The precisions and accuracies of the 17 analytes were all satisfied and the recoveries were 95.81%—102.42%. The content ranges of the 17 compounds were 782.68—1 034.27 μg/mL for neochlorogenic acid, 786.35—1 103.77 μg/mL for chlorogenic acid, 898.00—1 238.94 μg/mL for cryptochlorogenic acid, 82.85—115.17 μg/mL for caffeic acid, 226.02—461.63 μg/mL for 3,5-dicaffeoylquinic acid, 191.59—404.21 μg/mL for 3,4-dicaffeoylquinic acid, 243.62—298.51 μg/mL for isoforsythiaside, 978.43—1487.37 μg/mL for forsythoside A, 351.97—435.82 μg/mL for forsythin, 41.19—75.65 μg/mL for rutin, 40.28—73.73 μg/mL for baicalein, 10 080.54—10 820.35 μg/mL for baicalin, 40.88—50.51 μg/mL for scutellarin, 187.73—204.85 μg/mL for wogonoside, 144.92—335.08 μg/mL for oroxylin A-7-O-β-D-glucuronide, 9.30—25.58 μg/mL for wogonin, and 7.51—16.58 μg/mL for oroxylin A, respectively. Conclusion The developed UPLC-MS/MS method is simple, sensitive, and accurate, and could be applied for simultaneous determination of the 17 components in Shuang-Huang-Lian Oral Liquid.
Key words: UPLC-MS/MS     Shuang-Huang-Lian Oral Liquid     neochlorogenic acid     chlorogenic acid     cryptochlorogenic acid     caffeic acid     3,5-dicaffeoylquinic acid     3,4-dicaffeoylquinic acid     isoforsythiaside     forsythoside A     forsythin     rutin     baicalein     baicalin     scutellarin     wogonoside     oroxylin A-7-O-β-D-glucuronide     wogonin     oroxylin A    

双黄连口服液由金银花、连翘、黄芩3味药组成，具有清热解毒的功效[1, 2, 3]，临床上主要用于治疗由上呼吸道感染引起的头痛、发热等，而发挥药效的物质基础主要为酚酸类、苯乙醇苷类和黄酮类成分[4, 5, 6, 7, 8, 9]。中药复方制剂组成复杂，杂质较多，成分的量差异较大，且双黄连口服液中不少有效成分是以同分异构体形式存在，HPLC-UV法干扰多，耗时长，只能通过测定几个指标性成分对双黄连口服液进行质量控制[10, 11]。超高效液相色谱-串联质谱联用技术（UPLC-MS/MS）具有专属性好、灵敏度高、快速等特点，可以排除复杂基质中相似化学成分的干扰，为中药及其复方制剂的多组分快速分析提供了强有力的技术支持[12, 13, 14, 15]。

本实验采用UPLC-MS/MS同时测定双黄连口服液中的17个指标性成分（6个酚酸类成分、3个苯乙醇苷类成分、8个黄酮类成分），分别主要来源于金银花、连翘和黄芩，兼顾全方，以期对该制剂的质量控制提供全面、快速、可靠的分析方法。

1 仪器与材料

超高效液相色谱-TQD质谱联用仪，Acquity系统，MassLynx V4.1工作站，美国Waters公司；MicroCL 21R微量离心机，美国Thermo Scientific公司；微量移液器，上海科华实验系统有限公司；Milli-Q Synthesis 108超纯水仪，美国密理博公司；梅特勒-托利多XP6百万分之一天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

连翘苷（批号110821-201514）、黄芩苷（批号110715-201318）、替硝唑（批号100336-200703）对照品购自中国食品药品检定研究院；连翘酯苷A（批号L-012-140730）、绿原酸（批号L-007-130130）、新绿原酸（批号X-014-130126）、隐绿原酸（批号Y-067-140116）、3,5-二咖啡酰奎宁酸（批号Y-069- 130126）、3,4-二咖啡酰奎宁酸（批号Y-068-150113）、咖啡酸（批号K-003-130501）、异连翘酯苷（批号Y-184-131108）、野黄芩苷（批号Y-012-140801）、汉黄芩苷（批号H-019-140729）、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖苷（批号Q-046- 140111）、黄芩素（批号H-018-140729）、芦丁（批号L-001-130615）、汉黄芩素（批号H-029-140729）、氯霉素（批号2013091003）、千层纸素A（批号Q-020-140731）购自成都瑞芬思生物科技有限公司，质量分数均大于98%（采用色谱峰面积归一化法计算而得）。乙腈、甲醇，色谱纯，德国Merck公司；重蒸水，Milli-Q Synthesis 108超纯水仪制得。双黄连口服液，哈药集团三精制药股份有限公司提供，批号13020715、13020562、13021633、13022231、13060641，规格10 mL。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为0.4%甲酸水溶液（A）-乙腈-甲醇（4∶1，B），体积流量0.4 mL/min，梯度洗脱程序为0～0.5 min，10%～11% B；0.5～0.75 min，11%～13% B；0.75～1.5 min，13%～15% B，1.5～2 min，15%～10% B；2～3 min，10%～30% B；3～6.2 min，30%～70% B；6.2～6.5 min，70%～10% B；6.5～7 min，10%～10% B。柱温40 ℃；进样体积5 μL。

2.2 质谱条件

Waters三重四级杆串联质谱仪（TQD），离子化方式为电喷雾离子化（ESI），采用多反应监测离子扫描（MRM）模式；主要质谱参数：毛细管电压为3.5 kV，脱溶剂温度为400 ℃，脱溶剂气体积流量为800 L/h，锥孔气体积流量为50 L/h。各成分的部分质谱分析参数见表 1。双黄连口服液样品及混合对照品中17种成分及内标的提取离子流图见图 1。

表 1 17种成分的部分质谱分析参数 Table 1 MS parameters of 17 compounds

1-新绿原酸 2-绿原酸 3-隐绿原酸 4-咖啡酸 5-3,5-二咖啡酰奎宁酸 6-3,4-二咖啡酰奎宁酸 7-异连翘酯苷 8-连翘酯苷A 9-连翘苷 10-芦丁 11-黄芩素 12-黄芩苷 13-野黄芩苷 14-汉黄芩苷 15-千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖苷 16-汉黄芩素 17-千层纸素A IS1-替硝唑 IS2-氯霉素 1-neochlorogenic acid 2-chlorogenic acid 3-cryptochlorogenic acid 4-caffeic acid 5-3,5-dicaffeoylquinic acid 6-3,4-dicaffeoylquinic acid 7-isoforsythiaside 8-forsythoside A 9-forsythin 10-rutin 11-baicalein 12-baicalin 13-scutellarin 14-wogonoside 15-oroxylin A-7-O-glucuronide 16-wogonin 17-oroxylin A IS1-tinidazole IS2-chloramphenicol 图 1 双黄连口服液样品及混合对照品中17种成分及内标的提取离子流图 Fig.1 Extracting ion flow chart of 17 compounds and internal standards in Shuang-Huang-Lian Oral Liquid andmixed reference solution
2.3 对照品储备液的制备

分别精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、芦丁、汉黄芩素、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖苷、千层纸素A、野黄芩苷、连翘酯苷A、异连翘酯苷、连翘苷对照品适量置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，制得质量浓度分别为261、201、211、268、618、206、102、238、213、242、123、201、210、265、222、210及470 μg/mL的对照品储备液，4 ℃保存，备用。

2.4 内标溶液的制备

分别精密称取替硝唑和氯霉素适量置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，制得质量浓度分别为240 μg/mL和533 μg/mL的混合内标储备液，精密量取0.1 mL混合内标溶液至10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，得含替硝唑和氯霉素质量浓度分别为2.40 μg/mL和5.33 μg/mL的混合内标溶液。

2.5 供试品溶液的制备[16, 17]

精密量取1 mL双黄连口服液至100 mL量瓶中，用初始流动相乙腈-甲醇（4∶1）-0.4%甲酸水溶液（1∶9）稀释至刻度，摇匀后过0.22 μm滤膜，移取10 μL续滤液加入10 μL内标液和80 μL初始流动相，涡旋混匀，14 000 r/min离心10 min后取上清液，即得供试品溶液。

2.6 线性关系与定量限

分别精密量取“2.3”项下对照品储备液适量，置于10 mL量瓶中，用初始流动相乙腈-甲醇（4∶ 1）-0.4%甲酸水溶液（1∶9）稀释至刻度，得系列质量浓度的混合对照品溶液，取10 μL混合对照品溶液加入10 μL内标液和80 μL初始流动相，涡旋混匀，14 000 r/min离心10 min后取上清液，按照“2.1”和“2.2”项下条件测定。以质量浓度为横坐标（X），对照品与内标峰面积比值为纵坐标（Y）进行线性回归，得各成分的回归方程、相关系数及线性范围，以信噪比为10确定各成分的定量限（LOQ），结果见表 2。结果表明，各成分在各自的线性范围内具有良好的线性关系。

表 2 17种化学成分的线性回归方程及定量限 Table 2 Linear regression equations and LOQs of 17 compounds
2.7 精密度考察

取双黄连口服液（批号13021633），按“2.5”项下方法操作制备供试品溶液，按“2.1”和“2.2”项下条件测定，连续进样6次，以对照品与内标峰面积比值计算，17个成分的RSD分别为新绿原酸1.18%、绿原酸1.27%、隐绿原酸1.57%、咖啡酸0.45%、3,5-二咖啡酰奎宁酸1.25%、3,4-二咖啡酰奎宁酸1.20%、异连翘酯苷1.55%、连翘酯苷A 1.29%、连翘苷2.49%、芦丁1.09%、黄芩素1.37%、黄芩苷0.50%、野黄芩苷2.63%、汉黄芩苷0.67%、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖苷1.69%、汉黄芩素2.16%、千层纸素A 0.64%，表明仪器精密度良好。

2.8 重复性考察

取双黄连口服液（批号13021633），按“2.5”项下方法操作制备供试品溶液6份，按“2.1”和“2.2”项下条件测定，以对照品与内标峰面积比值计算，17个成分的RSD分别为新绿原酸1.23%、绿原酸1.41%、隐绿原酸1.96%、咖啡酸2.49%、3,5-二咖啡酰奎宁酸0.76%、3,4-二咖啡酰奎宁酸1.23%、异连翘酯苷0.67%、连翘酯苷A 1.48%、连翘苷0.27%、芦丁2.10%、黄芩素2.20%、黄芩苷2.12%、野黄芩苷0.71%、汉黄芩苷2.84%、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖苷2.58%、汉黄芩素1.60%、千层纸素A 2.48%，表明该方法重复性良好。

2.9 稳定性试验

取双黄连口服液（批号13021633），按“2.5”项下方法操作制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12 h按“2.1”和“2.2”项下条件测定，以对照品与内标峰面积比值计算，17个成分的RSD分别为新绿原酸2.10%、绿原酸2.00%、隐绿原酸1.62%、咖啡酸2.58%、3,5-二咖啡酰奎宁酸2.93%、3,4-二咖啡酰奎宁酸1.17%、异连翘酯苷1.48%、连翘酯苷A 1.08%、连翘苷1.67%、芦丁1.38%、黄芩素1.28%、黄芩苷1.61%、野黄芩苷2.13%、汉黄芩苷1.70%、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖苷1.97%、汉黄芩素1.71%、千层纸素A 1.55%，表明供试品溶液室温放置12 h稳定。

2.10 加样回收率试验

精密移取6份（批号13021633）1 mL双黄连口服液至100 mL量瓶中，并加入初始流动相至刻度得样品溶液，精密移取各对照品储备液适量置于10 mL量瓶中得混合对照品溶液，将样品溶液和混合对照品溶液按1∶1混合后精密移取10 μL加入10 μL内标液及80 μL初始流动相，涡旋混匀，14 000 r/min离心10 min后取上清液，即得供试品溶液，按“2.1”和“2.2”项下条件测定，计算各成分回收率，结果平均回收率及RSD分别为新绿原酸100.47%、1.11%，绿原酸96.72%、1.82%，隐绿原酸99.57%、1.24%，咖啡酸99.82%、2.69%，3,5-二咖啡酰奎宁酸102.42%、1.26%，3,4-二咖啡酰奎宁酸101.27%、2.85%，异连翘酯苷95.81%、1.25%，连翘酯苷A 101.85%、2.71%，连翘苷98.31%、2.84%，芦丁100.69%、2.30%，黄芩素101.04%、2.44%，黄芩苷97.21%、2.45%，野黄芩苷96.64%、0.91%，汉黄芩苷96.33%、1.26%，千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖苷99.41%、1.04%，汉黄芩素96.02%、2.51%，千层纸素A 100.70%、1.66%。

2.11 样品测定

取5个批次的双黄连口服液，按照“2.5”项下方法处理，平行制得各组待测样品溶液3份，进样分析，经计算得到各成分的量，结果见表 3。

表 3 不同批次双黄连口服液中多组分的定量测定 Table 3 Quantitative determination of multi-components in different batches of Shuang-Huang-Lian Oral Liquid
3 讨论

本实验考察了正、负离子扫描方式下待测物的响应强度，并进行比较，酚酸和黄酮类成分在正离子模式下 [M＋H]+ 响应较高，而苯乙醇苷类成分在负离子模式下 [M－H]−响应较高（连翘苷为 [M＋Na]+），因此采用正、负2种离子模式转换实现双黄连口服液中3类成分的同时测定，在流动相中加入不同浓度的甲酸溶液，结果发现0.4%的甲酸水溶液使正离子模式下的被测物响应增高，对负离子模式下的被测物影响较小，并且可以抑制色谱峰的拖尾，使同分异构体之间达到理想的分离效果；分别选择替硝唑和氯霉素作为正、负离子模式下的内标物，保留时间适当，峰形良好，实验过程中稳定可靠；本实验建立的同时测定双黄连口服液中酚酸类、黄酮类和苯乙醇苷类成分UPLC-MS/MS方法，17种成分在各自的质量浓度范围内，线性良好，分析时间较HPLC-UV法大大缩短，准确度、精密度、回收率、稳定性等均满足定量分析要求，并成功应用于5批双黄连口服液样品的多成分定量分析，为双黄连口服液的质量控制提供了一定的参考；所测5批样品中17种成分质量分数分别为新绿原酸782.68～1034.27 μg/mL、绿原酸786.35～1103.77 μg/mL、隐绿原酸898.00～1 238.94 μg/mL、咖啡酸82.85～115.17 μg/mL、3,5-二咖啡酰奎宁酸226.02～461.63 μg/mL、3,4-二咖啡酰奎宁酸191.59～404.21 μg/mL、异连翘酯苷243.62～298.51 μg/mL、连翘酯苷A 978.43～1 487.37 μg/mL、连翘苷351.97～435.82 μg/mL、芦丁41.19～75.65 μg/mL、黄芩素40.28～73.73 μg/mL、黄芩苷10 080.54～10 820.35 μg/mL、野黄芩苷40.88～50.51 μg/mL、汉黄芩苷187.73～204.85 μg/mL、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖苷144.92～335.08 μg/mL、汉黄芩素9.30～25.58 μg/mL、千层纸素A 7.51～16.58 μg/mL，其中绿原酸、黄芩苷及连翘苷的量均符合《中国药典》2010年版双黄连口服液项下规定，且批间差异较小，而量较小的成分如汉黄芩素、千层纸素A批间的量差异较大。

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