浮萍Spirodelae Herba为浮萍科（Lemnaceae）紫萍属Spirodela Schleid. 植物紫萍Spirodela polyrrhiza (L.) Schleid. 的带根干燥全草，其味辛，性寒，具发汗解表、透疹止痒、利水消肿、清热解毒等功效。浮萍含大量水溶性维生素、无机元素、黄酮及多糖等成分^{[1, 2]}。现代药理研究表明，浮萍具有抗癌、抗氧化、保肝、抗菌、增强免疫等多种生理活性^[3]。

核苷类化学成分对人体免疫、代谢以及肝脏、心血管及神经系统等发挥着重要的生理作用，且具有抗菌和抗病毒等生理活性^{[4, 5, 6, 7, 8, 9]}。目前，核苷类成分的同时测定已广泛运用于药材的真伪鉴别和品质评价^{[10, 11, 12]}。本研究运用LC-MS/MS法，建立不同产地浮萍药材中9种核苷类成分同时测定的方法，分析比较其组成与量差异，为该药材的进一步认识与评价提供科学依据。

LC-20A高效液相色谱仪，LC-20ADXR二元输液泵、DGU-20A3自动脱气装置、SIL-20A XR自动进样器、CTO-20AC柱温箱（日本Shimadzu公司）；Qtriple 5500质谱仪（美国AB SCIEX公司）；Analyst 1.5.2 Software质谱工作站软件（美国AB SCIEX公司）；Sartorius BT125D型十万分之一电子分析天平，TE124S型万分之一电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；KH-300SP型双频数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；TGL-16M台式高速冷冻离心机（长沙湘鹰离心机有限公司）；微量移液器（芬兰BIOHIT公司）；SAGA-10TY实验室级超纯水器（南京易普易达科技发展公司）。

对照品胸腺嘧啶（批号B1326009）、胸苷（批号1001569135）、2′-脱氧尿苷（批号1090557）、尿苷（批号200202）、2′-脱氧肌苷（批号L1224040）、黄嘌呤（批号F1205052）、胞嘧啶（批号1328014）、肌苷（批号K1228002）、次黄嘌呤（批号J1225007）均购自阿拉丁公司，质量分数均大于98%。

乙腈、甲酸为色谱纯（德国Merck公司），其余试剂为分析纯，水为超纯水（实验室自制）。

浮萍样品分别实地采集于安徽、山东、福建等省份，经南京中医药大学吴启南教授鉴定为浮萍科植物紫萍Spirodela polyrrhiza (L.) Schleid. 的干燥全草，留样凭证存放于南京中医药大学中药鉴定实验室。具体信息见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 样品信息 Table 1 Sample information 编号 产地 编号 产地 S1 广东湛江 S8 山东青岛 S2 安徽亳州 S9 山东烟台 S3 安徽合肥 S10 安徽黄山 S4 安徽芜湖 S11 河南郑州 S5 安徽蚌埠 S12 福建福州 S6 河南洛阳 S13 湖北武汉 S7 安徽池州

表 1 样品信息 Table 1 Sample information

Waters Xbridge^TM Amide 色谱柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流动相：0.1%甲酸的水（A）- 0.1%甲酸的乙腈（B）溶液，梯度洗脱：

0～4 min，20% A；4～8 min，20%～50% A；8～12 min，50%～20% A：12～14 min，20% A。体积流量为0.6 mL/min；柱温30 ℃，进样量1 μL。

离子源：Turbo V，电离模式：ESI⁺；采集方式提取离子流（MRM）；离子源温度：550 ℃，喷雾电压5 500 V。

精密称量干燥至恒定质量的9种对照品适量，分别置于10 mL量瓶中，加水溶解定容，配成质量浓度分别为0.510、0.525、0.687、0.572、0.579、0.501、0.718、0.690、0.526 mg/mL的各对照品储备液。分别取不同体积的各储备液置于10 mL量瓶中逐级加水稀释，得到不同质量浓度的混合对照品溶液。

精密称取干燥至恒定质量的各样品粉末1.0 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入20 mL超纯水，室温下超声提取60 min（功率500 W、频率40 Hz），提取上清液于12 000 r/min转速下离心10 min，吸取上清液过0.22 μm微孔滤膜待用。

精密吸取“2.2.1”项下的混合对照品溶液，逐级稀释为6个不同浓度的系列混合对照品溶液，0.22 μm微孔滤膜滤过，在“2.1”项色谱-质谱条件下进样分析，以对照品的质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），建立线性回归方程、相关系数和线性范围；分别以各化合物的信噪比（S/N）等于3和10时所对应的浓度确定为最低检测限（LOD）、最低定量限（LOQ），结果见表 2和图 1。

表 2(Table 2)

表 2 9种核苷类成分标准曲线、定量限和检测限 Table 2 Calibration curves, LODs, and LOQs of nine nucleosides 化合物 回归方程 r 线性范围/(μg∙mL−1) LOD/(ng∙mL−1) LQD/(ng∙mL−1) 胸腺嘧啶 Y＝925.01 X＋21 778 0.999 8 0.159～10.20 20.72 69.07 胸苷 Y＝4 958 X－137 687 0.999 9 0.164～10.50 6.89 22.97 2′-脱氧尿苷 Y＝7 446.1 X＋1 000 000 0.998 7 0.214～13.70 15.24 50.80 次黄嘌呤 Y＝6 656.8 X＋808 671 0.998 9 0.175～11.20 1.53 5.10 尿苷 Y＝2 091.1 X＋42 108 0.999 8 0.181～11.60 5.68 18.93 2′-脱氧肌苷 Y＝7 670.4 X－229 992 0.999 8 0.103～ 9.92 2.11 7.03 黄嘌呤 Y＝4 857.2 X＋270 129 0.999 1 0.149～14.30 4.99 16.63 肌苷 Y＝6 024.3 X－182 302 0.999 9 0.213～13.60 2.10 7.00 胞嘧啶 Y＝2 954.9 X＋177 086 0.999 1 0.164～10.50 1.79 5.97

表 2 9种核苷类成分标准曲线、定量限和检测限 Table 2 Calibration curves, LODs, and LOQs of nine nucleosides

1-胸腺嘧啶 2-胸苷 3-2′-脱氧尿苷 4-尿苷 5-2′-脱氧肌苷 6-黄嘌呤 7-胞嘧啶 8-肌苷 9-次黄嘌呤 1-thymine 2-thymidine 3-2′-deoxyuridine 4-uridine 5-2′-deoxyinosine 6-xanthine 7-cytosine 8-inosine 9-hypoxanthine 图 1 9种核苷样品的MRMFig.1 MRM of nine nucleosides in SpirodelaeHerba

精密吸取同一混合对照品溶液连续进样5次，分别记录9种核苷的峰面积，计算其RSD在0.76%～2.67%；表明仪器精密度良好。取同一样品5份，按照“2.2.2”项方法制备供试品溶液，进样测定，计算各核苷成分质量分数的RSD值在1.42%～2.78%；表明方法重复性良好。取同一样品供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、18、24 h测定9种核苷的峰面积并计算其RSD值在1.02%～3.07%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

精密称取6份已测定的浮萍样品1.0 g，分别加入一定量的各对照品溶液，根据“2.2”项下方法制备供试品溶液，根据样品测定方法进样，计算各核苷的平均回收率及RSD，结果表明，该9种核苷的平均回收率在94.4%～101.9%，RSD在1.73%～3.58%。

取13批样品，分别按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项条件分析，以标准曲线法计算13批样品中9种类成分的质量分数，结果见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 浮萍中核苷类成分质量分数 Table 3 Contents of nucleosides in SpirodelaeHerba (n = 3) 样品 质量分数/(μg·g−1) 胸腺嘧啶 胸苷 2′-脱氧尿苷 次黄嘌呤 尿苷 2′-脱氧肌苷 黄嘌呤 肌苷 胞嘧啶 总量 S1 70.87 67.13 39.50 20.00 105.91 43.67 172.93 97.12 5.75 622.88 S2 60.50 td> 57.70 35.61 139.42 104.23 44.63 104.71 76.00 4.00 626.80 S3 5.32 39.51 52.78 229.10 242.30 63.30 235.32 170.02 22.16 1 059.81 S4 78.92 79.71 27.21 192.65 270.19 60.05 86.43 200.61 30.05 1 025.82 S5 63.03 50.83 38.60 138.07 84.72 44.19 96.20 62.12 3.98 581.74 S6 34.39 66.56 14.03 156.90 255.08 37.78 65.85 150.40 25.06 806.05 S7 55.16 38.00 7.11 160.91 318.27 25.55 51.31 288.70 27.94 972.95 S8 78.43 73.17 28.72 187.73 232.35 55.83 99.00 172.95 23.68 951.86 S9 40.32 84.25 44.39 231.02 408.30 67.20 156.37 213.04 45.63 1 290.52 S10 143.23 145.73 129.24 218.53 392.71 129.30 451.05 294.73 15.84 1 920.36 S11 57.57 99.52 69.65 229.17 34.21 77.82 348.15 97.29 2.35 1 015.71 S12 65.67 132.87 92.42 231.30 367.83 109.75 210.30 250.03 20.47 1 480.64 S13 40.05 80.80 45.91 163.82 139.93 59.43 117.10 172.12 12.09 831.25

表 3 浮萍中核苷类成分质量分数 Table 3 Contents of nucleosides in SpirodelaeHerba

浮萍样品中9种核苷测定表明，浮萍中9种目标核苷在组成上无差异均能用该方法检出，而质量分数差异较大，从核苷总量来看，S10最大，其次为S12、S9； S3、S4、S6、S7、S8、S11、S13居中；S1、S2、S5最小。各核苷所占比例显示，2′-脱氧尿苷、2′-脱氧肌苷在13个产地样品中质量分数均较低；胞嘧啶最低；次黄嘌呤、尿苷、肌苷、黄嘌呤量较高。

以核苷类成分量为分析指标，应用SPSS19.0统计软件进行主成分分析。提取特征值大于1的3个主成分，其特征值、贡献率和累积贡献率如表 4所示。前3个主成分的累积贡献率达到86.629%，采用方差极大法得到的解释总方差和旋转因子载荷图表明浮萍药材的第1主成分与胸腺嘧啶、胸苷、2′-脱氧尿苷、黄嘌呤、胞嘧啶呈正相关；第2主成分与2′-脱氧肌苷、肌苷、次黄嘌呤呈正相关；第3主成分与胸腺嘧啶呈正相关。因浮萍药材中9种核苷总方差的70%以上贡献率来自第1、2主成分，故胸腺嘧啶、胸苷、2′-脱氧尿苷、2′-脱氧肌苷、黄嘌呤、胞嘧啶、肌苷、次黄嘌呤为浮萍药材的特征核苷类成分。各产地浮萍样品的主成分分析综合得分见表 5，可以看出山东烟台（S9）得分最高，河南郑州（S11）得分最低。

表 4(Table 4)

表 4 主成分的初始特征值及贡献率 Table 4 Initial eigenvalues and contribution rate of principal components 成分 初始特征值 特征值 贡献率/% 累积贡献率/% 1 4.691 52.121 52.121 2 2.030 22.555 74.677 3 1.076 11.952 86.629 4 0.492 5.463 92.091 5 0.278 3.089 95.180 6 0.226 2.512 97.692 7 0.116 1.288 98.981 8 0.065 0.723 99.704 9 0.027 0.296 100

表 4 主成分的初始特征值及贡献率 Table 4 Initial eigenvalues and contribution rate of principal components

表 5(Table 5)

表 5 不同产地浮萍样品的主成分综合得分 Table 5 Comprehensive scores of principal component in Spirodelae Herba from different habitats 编号 主成分1 主成分2 F 综合排名 S1 −0.852 8 −1.234 8 −0.423 8 12 S2 −0.842 0 −0.871 9 −0.299 2 10 S3 −0.189 3 0.475 0 0.163 0 5 S4 −0.009 9 0.734 0 0.251 9 3 S5 −0.918 4 −0.959 9 −0.329 4 11 S6 −0.728 3 0.661 9 0.227 1 4 S7 −0.625 3 1.435 3 0.492 6 2 S8 −0.173 0 0.355 8 0.122 1 6 S9 −0.406 9 1.604 3 0.550 6 1 S10 2.533 5 −0.670 7 −0.230 2 9 S11 0.323 4 −1.504 2 −0.516 2 13 S12 1.393 9 0.230 6 0.079 9 7 S13 −0.311 9 −0.255 3 −0.087 6 8

表 5 不同产地浮萍样品的主成分综合得分 Table 5 Comprehensive scores of principal component in Spirodelae Herba from different habitats

应用SPSS19.0统计软件对本实验所测13种产地浮萍样品中9种核苷量进行聚类分析，将其聚为2大类，第1类：S2、S5、S1、S6、S13、S4、S8、S7、S3、S11；第2类：S9、S12、S10，第1类又可根据量差异分为3大类，见图 2。

图 2 系统聚类分析图Fig.2 Systematic cluster analysis

本实验从提取方法到检测波长与色谱柱的选择均通过实验和文献考察，超声提取法具有操作简单、耗时短、提取率高等特点，经优化后选择料液比为1∶10，提取时间60 min。核苷类成分在260 nm附近有较高吸收，因此选择260 nm作为检测波长。Waters Xbridge^TM Amide色谱柱对极性较强的化学物质具有较好的保留作用，适合于核苷类成分的分离。另外，色谱与质谱条件均最佳。

本实验以各样品核苷总量为出发点，初步得出13批样品中9种核苷总量的差异；并对样品中各种核苷的比例进行分析，得到13个不同产地浮萍样品中9种核苷的分布趋势。采用主成分分析法对13个产地浮萍样品进行综合得分排名，评价了9种核苷成分的量差异；采用系统聚类分析方法再次分类。3种分析方法所得结果基本一致，山东烟台核苷量最高，河南郑州最低。主成分分析中排名在2、3的分别是安徽池州与安徽芜湖的样品；排名中间的有河南洛阳、安徽合肥、山东青岛、福建福州、湖北武汉；安徽黄山、安徽亳州、安徽蚌埠、广东广州、河南郑州依次排名最后。聚类分析结果中，9种核苷量能在一定程度上将浮萍药材按产区分开，如安徽亳州与合肥、芜湖与池州药材相似，这也和主成分分析的结果相一致。山东青岛与烟台两地又自成一类，这表明各产区浮萍药材中该9种核苷成分具有较强的地域差异性，同一省份不同城市的药材也存在差异。

从整体上来看，9种核苷量的测定并不能直观的区分浮萍的产地，造成这种差异的原因有以下2个方面：第一，地理位置上的差异，气候、海拔、经纬度、温度等大环境都会造成浮萍的质量差异，从而引起各项检测指标的变化；第二，水体环境的差异，浮萍属水生植物，生长环境和陆生药用植物完全不同，影响其生长发育的外界因素复杂，不同产地的浮萍核苷量差异是由不同的水环境决定的，受水体污染的影响，水生药用植物的品质每况愈下。且水具有流动性，聚类分析结果中不同省份所产浮萍能聚为一类极有可能是流动的水体所致，另外，浮萍生长的水环境周围相同或相似的工业模式也是造成这一结果的重要原因，故浮萍药材的品质评价还可间接反映生长地区的水体情况。

本实验建立了从9种核苷量的差异来比较不同产地浮萍质量的方法，得出了13个产地浮萍药材的量变化，可为浮萍药材的进一步开发提供依据，但仍存在局限性，除核苷外多糖、氨基酸及一些次生代谢物也是影响浮萍品质的主要成分。此外，药材的干燥方式也能引起量差异，因此，还需综合考虑各种因素，进一步探索评价浮萍药材品质的新方法。