肝损伤是临床上常见的一类疾病，除遗传因素外，很多因素都可以诱发肝损伤。药物的护肝作用是现今研究的热点。萱草花Hemerocallis citrina Baroni，又名黄花菜，《本草纲目》中记载，有利湿热、宽胸隔、安五脏、治酒疸，安寐解郁等作用^[1]，中医用来治疗胸隔烦热、肝性黄疸、改善肝功能^[2]。萱草花总黄酮（Hemerocallis citrina total flavonids，HCTF）是其主要成分之一。大量研究表明，HCTF具有护肝、抗抑郁、镇静催眠、抗氧化等药理作用^{[3, 4]}。本实验在体内采用CCl₄诱导小鼠肝氧化损伤模型，在体外采用H₂O₂诱导肝细胞损伤模型，观察肝组织病理变化及肝细胞损伤过程中肝X受体（LXR）α和脂肪酸合成酶（FAS）mRNA及蛋白表达变化，探讨HCTF对体内和体外肝氧化损伤的保护作用及其可能机制。

昆明种小鼠65只，雄性，体质量（20±2）g，SPF级，长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，合格证号SCXK（吉）-2010-0001。

人肝细胞株HL-7702，购于中国科学院上海细胞生物学研究所。

HCTF自制；CCl₄，宜兴化学试剂三厂；博莱霉素、H₂O₂，美国Sigma公司；RPMI 1640培养基，美国Gibgo公司；胎牛血清、胰蛋白酶，杭州四季青生物工程材料有限公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙氨酸转氨酶（ALT）、乳酸脱氢酶（LDH）、天冬氨酸转氨酶（AST）试剂盒，南京建成生物工程研究所；引物由上海生工生物工程有限公司提供。

CM1900冰冻切片机，德国Leica公司；UV-6300分光光度计，上海美谱达仪器有限公司产品；DYY-11酶标仪，北京市六一仪器厂；3K30超速冷冻离心机，美国Sigma公司；双人超净工作台，上海基星生物科技有限公司；CO₂培养箱，上海力申仪器有限公司；BX41TF倒置显微镜，日本Olympus公司。

萱草花药材，购于湖南祁阳，经吉林医药学院药学院雷均涛教授鉴定为萱草花Hemerocallis citrina Baroni。取粗粉适量，添加20倍量70%乙醇，加热、回流提取4 h，提取3次，冷冻干燥，得提取物粉末（得率0.94%），按照文献方法^[5]测定，提取物粉末中含总黄酮5.6%。取提取物粉末加水溶解成10 g/L水溶液（总黄酮0.56 g/L），作为大孔吸附树脂纯化准备液。取预先处理好的AB-8大孔吸附树脂，按照径高比1∶6湿法装柱，取准备液6倍柱体积（BV）上样（2 mL/min），上样结束，用6 BV蒸馏水洗脱除杂（2 mL/min）。加入30%乙醇洗脱，收集3 BV洗脱液，洗脱液浓缩回收乙醇，冷冻干燥，得纯化粉末，相当于生药材28 g/g，纯化粉末含总黄酮26.5%。以蒸馏水配制成适宜质量浓度溶液，备用。

将65只昆明种小鼠按体质量随机分为5组，每组13只，分别为对照组，模型组，HCTF 25、50、100 mg/kg组。HCTF各组小鼠ig给药，给药体积20 mL/kg，每天1次，连续30 d。对照组和模型组ig等体积蒸馏水。

除对照组外，各组末次给药2 h后，小鼠ip 3.2% CCl₄的玉米油溶液5 mL/kg^[6]。

模型制备后，禁食24 h，将小鼠脱颈椎处死，取肝组织，4 ℃生理盐水冲洗，加双蒸水冰浴匀浆，10%匀浆液离心，取上清。取10%肝组织匀浆，考马斯亮蓝法测定总蛋白浓度，按照试剂盒说明书操作，硝酸还原酶法检测GSH-Px水平^[7]，TBA法检测MDA水平^[8]，黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性^[7]。

取小鼠肝组织3 mm×3 mm大小，10%甲醛溶液固定48 h。冲洗、脱水、透明、浸腊、包埋后，切8 μm厚度切片，脱蜡，进行HE染色，脱水封片后，用显微镜观察。

取96孔板接种5×10⁴/mL对数生长期HL-7702细胞，无血清RPMI 1640培养液培养24 h。弃上清，对照组加入含15%胎牛血清的完全培养基；模型组加入H₂O₂ 25 μmol/mL，给药组先加入2.5、5.0、10.0 μg/mL的HCTF作用细胞24 h，再加入终浓度为25 μmol/mL的H₂O₂培养12 h。

将HL-7702细胞接种于96孔板，每孔5×10³个细胞，接种150 μL，分组及加药处理同“2.3.1”项。加入MTT溶液（5 mg/mL）每孔20 μL，实验设4复孔，孵育4 h，弃上清，每孔加150 μL DMSO，微型震荡器震荡10 min。酶标仪检测490 nm波长各孔吸光度（A）值，考察HCTF对H₂O₂损伤HL-7702细胞的保护作用，结果用存活率表示。存活率＝给药组A值/对照组A值。实验重复3次，取平均值。

取HL-7702细胞，以每孔5×10⁴个细胞接种于24孔板，每孔150 uL体积，分组及加药处理同“2.3.1”项。各因素处理后收集细胞培养上清液，DTNB法检测GSH-Px水平，TBA法检测MDA水平，比色法检测细胞内SOD活性，分别按照试剂盒说明书操作。

细胞处理及分组给药同“2.3.3”项，ELISA法测定ALT、LDH和AST水平，按照试剂盒要求操作。

细胞处理及分组给药同“2.3.3”项。收集细胞，用TRIzol^®试剂提取细胞的总RNA，将细胞总RNA分别稀释为1 μg/μL，以提取的总RNA为模板，反转录mRNA为cDNA。扩增引物根据Entrez Nucleotide database相关基因序列^[10]，应用Primer Premier 5引物设计软件设计，LXRα上游引物5’-CTGCCCAGCAACAGTGTAAC-3’，下游引物5’-CTGCTTTGGCAAAGTCTTCCC-3’；FAS上游引物5’-TTGCTAGATTATCGTCCAAAAGTGT-3’，下游引物5’-GCACTTGGTGTTGCTGGTGAGT-3’。以cDNA为模板，进行PCR扩增。电泳，凝胶分析系统进行灰度分析。

根据文献方法^[11]，HL-7702细胞1×10⁵个接种于6孔板，培养24 h，分组及加药处理同“2.3.1”项。收集细胞，提取蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转至PVDF膜，分别加入LXRα、FAS一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，DAB显色。Imagel凝胶成像系统采集图像，SPSS 13.0软件定量分析条带净灰度值，并与内参GAPDH比较，计算比值，比较各组差异。

数据以x±s表示，应用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，组间计量比较采用t检验。

与对照组比较，模型组小鼠GSH-Px和SOD活性显著降低、MDA水平显著升高（P＜0.05、0.01），说明CCl₄引起了小鼠肝氧化损伤。HCTF 50、100 mg/kg剂量组小鼠肝组织的GSH-Px和SOD活性比模型组显著升高（P＜0.05、0.01），HCTF各剂量组MDA水平与模型组比较显著降低（P＜0.05、0.01）。提示，HCTF可以抑制CCl₄肝损伤小鼠肝组织中脂质过氧化物的生成，提高肝组织抗氧化酶活性，对CCl₄引起的肝损伤具有保护作用。结果见图 1。

与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01，下同 *P < 0.05 **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 ##P < 0.01 vs model group, same as below 图 1 HCTF对CCl4肝损伤小鼠肝组织GSH-Px、SOD活性和MDA水平的影响(x±s,n=13)Fig.1 Effect of HCTF onactivities of GSH-Px and SOD, and content of MDA in liver tissue of mice with liver injury induced(x±s,n=13)

HE染色后，显微镜可见，对照组肝细胞整齐排列，胞浆染色均匀，无深染及空泡，细胞核均一未见融合；模型组肝细胞肿胀变形，出现空泡及大量血细胞，细胞核出现部分碎裂及溶解；HCTF 25 mg/kg组肝细胞结构基本完整，有部分细胞核出现深染或溶解；HCTF 50、100 mg/kg组肝细胞排列基本整齐，有个别空洞及深染，有极少细胞核结构改变。结果见图 2。

图 2 HCTF对CCl4肝损伤小鼠肝组织形态结构的影响Fig.2 Effect of HCTF on morphology of hepatocyte of mice with liver injury induced by CCl4

MTT测定结果显示，模型组细胞存活率降低，与对照组比较差异显著（P＜0.01）；与模型组比较，HCTF 5.0、10.0 μg/mL组细胞存活率显著提高（P＜0.01）。结果见图 3。

图 3 HCTF对HL-7702细胞存活率、MDA水平、GSH-Px和SOD活性的影响(x±s,n=5)Fig.3 Effect of HCTF on cell viability, content of MDA, and activities of GSH-Px and SOD in HL-7702 cells(x±s,n=5)

与对照组比较，模型组细胞内MDA水平增加，不同质量浓度的HCTF孵育，可不同程度地抑制MDA水平增加，说明HCTF可抑制生物体的脂质过氧化反应，呈一定的剂量依赖性。与对照组比较，模型组GSH-Px活性显著降低（P＜0.01），HCTF孵育后，各剂量组的GSH-Px活性均有所升高，2.5 μg/mL组与模型组比较差异不显著，而5.0、10.0 μg/mL组均差异显著（P＜0.05），表明HCTF可以提高抗氧化酶活性。与模型组相比，HCTF各剂量组的SOD活性均显著提高（P＜0.05、0.01），表明HCTF能提高HL-7702细胞SOD酶活性，并呈量效关系。以上结果提示，HCTF能够抑制H₂O₂对HL-7702细胞的氧化损伤。结果见图 3。

H₂O₂损伤HL-7702细胞后，促进肝细胞内酶的释放，上清中ALT、LDH、AST活性明显增加，与对照组比较差异显著（P＜0.05、0.01）；HCTF 5.0、10.0 μg/mL组与模型组比较，上清中ALT、LDH、AST活性明显受到抑制（P＜0.05、0.01）。提示HCTF可以改善H₂O₂引起的HL-7702细胞损伤。结果见图 4。

图 4 HCTF对HL-7702细胞ALT、LDH、AST活性的影响(x±s,n=5)Fig.4 Effects of HCTF on activities of ALT, LDH, and AST in HL-7702 cells(x±s,n=5)

与对照组比较，模型组肝细胞LXRα、FAS mRNA表达明显增高（P＜0.01），与模型组比较，HCTF 5.0、10.0 μg/mL组细胞中LXRα、FAS mRNA水平明显降低（P＜0.05、0.01），提示HCTF可以下调H₂O₂诱导的HL-7702细胞的LXRα、FAS mRNA高表达。结果见图 5。

图 5 HL-7702细胞中LXRα和FAS mRNA表达(x±s,n=5)Fig.5 mRNA expression of LXRα and FAS in HL-7702 cells(x±s,n=5)

与对照组比较，模型组LXRα、FAS蛋白表达增高，差异显著（P＜0.01）；与模型组比较，HCTF各组LXRα、FAS蛋白表达有不同程度降低，5.0、10.0 μg/mL组差异显著（P＜0.05、0.01）。提示HCTF可以下调H₂O₂损伤肝细胞后引起的LXRα、FAS蛋白的高表达。结果见图 6。

图 6 HL-7702细胞中LXRα和FAS蛋白表达(x±s,n=5)Fig.6 Protein expression of LXRα and FAS in HL-7702 cells(x±s,n=5)

氧自由基（oxygen radical）与肝损伤密切相关，在酒精性肝损伤、肝纤维化等病变中，均观察到有

氧化应激的参与^[12]。超氧阴离子、羟基等自由基可以间接或直接损伤肝细胞，使肝细胞膜中的脂质、蛋白质和DNA出现损伤，细胞变性坏死，引发肝疾病^[13]。SOD活性及MDA水平可以反应机体抗氧化能力及脂质过氧化水平。体内实验结果显示，HCTF在CCl₄引起的肝损伤小鼠模型中，明显提高了肝组织中抗氧化酶GSH-Px和SOD的活性，减少脂质过氧化物MDA的生成，减轻了CCl₄对小鼠肝组织的损害。同时，体外实验结果也显示，HCTF各剂量组肝细胞的SOD活性比H₂O₂模型组均显著提高，不同程度地抑制MDA水平的增加，这些都表明HCTF对肝细胞具有保护作用，降低了H₂O₂引起的HL-7702细胞氧化损伤。综合结果提示，HCTF的肝保护作用可能是通过提高机体抗氧化能力，加强清除氧自由基能力，降低膜脂质过氧化水平而实现的。

ALT、LDH与AST是目前临床上反映肝细胞膜损伤的敏感指标^[14]，它们主要由肝细胞合成、分泌，ALT、LDH主要存在于肝细胞浆中，AST主要存在于肝细胞线粒体中，当炎症、氧化应激、免疫等因素使肝细胞受损时，肝细胞膜被破坏，细胞内的ALT等大量溢出，导致细胞外ALT、LDH、AST水平急剧升高。ALT、LDH、AST活性高低可以敏感地反映肝细胞损伤的程度^[15]。本实验结果显示，与模型组相比，HCTF各剂量组肝细胞上清液中的ALT、LDH、AST水平降低，表明HCTF对肝细胞具有保护作用，降低了H₂O₂引起的HL-7702细胞氧化损伤程度。提示，HCTF的肝保护作用可能是通过提高机体抗氧化的能力，加强清除氧自由基能力，降低膜脂质过氧化水平而实现的。

有研究报道，LXR作为胆固醇代谢的感受器，可以调节细胞的增殖与分化及炎症反应^{[16, 17]}。LXR有LXRα和LXRβ 2种亚型。LXRα是脂肪酸代谢的关键调控位点，主要表达在肝脏、脂肪组织、巨噬细胞中，在脂肪的生成、分泌、脂质过氧化等过程发挥作用^[18]。FAS是脂肪合成的关键酶，LXRα直接活化FAS的转录，促进脂肪酸的合成及抑制脂酸的β氧化，从而引起三酰甘油在肝细胞内蓄积和活性氧（ROS）增加及炎症因子的生成，导致肝细胞的损伤^[19]。LXR的信号传导通路参与了各种病理状态下肝功能的调节。本实验以H₂O₂诱导体外肝细胞氧化损伤模型，发现模型组肝细胞的LXRα、FAS mRNA及蛋白表达都高于对照组，这与相关报道相符^{[20, 21]}。本研究显示HCTF可改善肝细胞HL-7702中LXRα、FAS的表达水平，综合HCTF在肝细胞氧化应激损伤过程中具有的保护作用，分析HCTF的抗氧化机制可能与减轻LXRα、FAS蛋白表达有关，这也是本研究下一步关注的内容之一。

综上所述，HCTF对肝细胞保护作用机制可能是通过下调LXRα、FAS mRNA基因和蛋白表达，抑制LXR信号传导通路的脂肪合成关键酶FAS的转录，加强了清除氧自由基的能力而实现的。