野菊花Chrysanthemi Indici Flos是菊科（Compositae）菊属Chrysanthemum L. 植物野菊Chrysanthemum indicum L. 的干燥头状花序，具有清热解毒、清肝明目的功效^[1]，临床主要用于清热、抗菌、抗炎、抗病毒、降血压^[2]，主要活性成分为挥发油类、倍半萜类、黄酮类等化合物。

氧自由基的存在和活动是许多代谢紊乱的重要诱因，进而引起生物体内各种疾病的产生，如心脑血管疾病、癌症、糖尿病^[3]、白内障^[4]，预防和治疗这些疾病可以采用向机体补充抗氧化剂的办法来进行，黄酮类成分是目前国内外公认的具有抗氧化活性的成分之一。建立一种灵敏可靠的野菊花总黄酮抗氧化活性的测定方法对其药用资源的开发和利用十分重要。目前，野菊花总黄酮抗氧化活性的测定方法主要有1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法、邻苯三酚自氧化法、羟基自由基清除能力法等^[5]。化学发光法具有灵敏度高、操作简便、测定快速等优点，已被广泛地应用于抗氧化活性的测定^[6]。目前，关于化学发光法测定野菊花中总黄酮抗氧化活性的研究未见报道。

前期采用经典回流提取法、超声提取法、组织破碎提取法3种不同提取方法对野菊花中总黄酮指标成分蒙花苷和木犀草素的提取工艺进行了研究^[7]，本实验在前期根据野菊花中有效成分的量优选的提取工艺条件基础上，采用流动注射发光法测定了野菊花中黄酮类成分的抗氧化活性，并考察了野菊花中总黄酮的量以及主要的黄酮类指标成分蒙花苷和木犀草素的量和抗氧化活性的关系，建立了其抗氧化活性评价方法，优选了野菊花中抗氧化活性部位的最佳提取方法，为下一步合理开发和利用野菊花药材资源中黄酮类成分提供参考。

UV-2500紫外-可见分光光度计，日本岛津；IFFM-D型流动注射化学发光仪，西安瑞迈电子科技有限公司，蠕动泵，六通阀，聚四氟乙烯管；IFFS-A型多功能化学发光检测器，西安瑞迈电子科技有限公司；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；SHZ-DIII型循环水式真空泵，巩义市予华仪器公司；KQ-300DE型超声清洗机，昆山市超声仪器有限公司；闪式提取器，北京金鼎科技发展有限公司；电热套，河南铭骏仪器仪表有限公司。

野菊花采自河南省信阳市，由郑州大学潘成学副教授鉴定为菊科菊属植物野菊Chrysanthemum indicum L. 的干燥头状花序，标本保存于郑州大学药学院标本馆。75%乙醇、2 mol/L KOH溶液、10 mmol/L鲁米诺储备液（用时以KOH溶液稀释配制）、5 mmol/L铁氰化钾储备液、维生素C（VC）标准品（批号91184，质量分数＞98%），购于上海源叶生物科技有限公司；芦丁对照品购于中国食品药品检定研究院，批号为100080-200306，质量分数＞98%；所用试剂均为分析纯；水为二次蒸馏水。

称取野菊花药材40 g于圆底烧瓶中，加沸石，浸泡20 min，用75%乙醇溶液320 mL，加热回流60 min，提取3次，滤过，合并滤液，浓缩得浸膏，干燥称质量为16.85 g，得膏率42.12%。

称取野菊花药材粉末40 g于锥形瓶中，加入320 mL 75%乙醇溶液，浸泡20 min，利用超声波清洗机超声提取3次，提取时间为30 min，提取3次，滤过，合并滤液，浓缩得浸膏，干燥称质量为16.63 g，得膏率为41.57%。

称取野菊花药材粉末40 g，加入75%乙醇溶液320 mL，浸泡20 min，利用闪式提取器进行组织破碎提取2 min，提取3次，每次滤过前静置平衡10 min，合并滤液，浓缩得浸膏，干燥称质量为16.84 g，得膏率为42.10%。

精密称取5 mg芦丁对照品，置于25 mL量瓶中，加75%乙醇使其溶解，稀释至刻度，摇匀备用。

分别称取3种提取方法提取得到的浸膏0.5 g，置于25 mL量瓶中，加入75%乙醇溶解，稀释至刻度，摇匀备用。

野菊花提取物溶液中移取样品液0.1 mL置于10 mL比色管中，用1% AlCl₃溶液定容至刻度。以1% AlCl₃溶液为参比液，在400～800 nm扫描，得到其吸收光谱，最大吸收波长为420 nm。

移取上述芦丁对照品溶液1 mL置于10 mL比色管中，1% AlCl₃溶液定容至刻度。以1% AlCl₃溶液为参比液，在400～800 nm扫描，最大吸收波长为420 nm。

准确吸取芦丁对照品溶液0、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75 mL，分别置于10 mL比色管中，用1% AlCl₃溶液定容至刻度，以1% AlCl₃溶液为参比液，在420 nm波长处分别测定其吸光度（A）值，求得A值与质量浓度（C）关系的回归方程A＝41.218 C－0.006 2，r²＝0.998 9。结果表明芦丁对照品在0.005～0.04 mg/mL与A值呈良好的线性关系。

取对照品及3种不同方法提取的供试品溶液于室温分别放置0、5、10、15、20、30 min后，测定A值，RSD分别为0.1%、0.18%、0.1%、0.16%。结果表明对照品溶液及样品溶液在30 min内稳定。

精密吸取对照品溶液适量，按“2.2.4”项下方法操作，连续测定6次，RSD为0.18%，结果表明仪器精密度良好。

另取野菊花药材粉末40 g共18批，分别按照“2.1.1”“2.1.2”和“2.1.3”项下的方法各提取测定6批，3种方法的RSD值均小于3%，结果表明方法的重复性良好。

分别精密移取160、180、200 μL质量浓度分别为0.85、0.53、0.52 mg/mL的3种样品储备液于10 mL比色管中，再分别精密加入芦丁对照品溶液，按“2.2.2”和“2.2.4”项下方法进行制备及测定，并计算回收率，3种不同提取方法的平均回收率分别为104.90%、98.22%、95.83%，RSD值分别为0.88%、1.52%、1.16%。

精密移取3种提取方法的样品储备液，按“2.2.2”和“2.2.4”项条件进行制备与定量测定，分别计算野菊花总黄酮的量，结果回流提取法、超声提取法、组织破碎提取法得到提取物中总黄酮的量分别为12.60、11.02、10.95 mg/g。

实验流路如图 1所示，在比色管中加入50 μmol/L鲁米诺溶液、0.2 mol/L KOH溶液、30 μmol/L铁氰化钾溶液，鲁米诺溶液（KOH溶液配制）经a通道、水作为载流经b通道一起进入，铁氰化钾溶液经c通道（副下内通道）、样液经d通道（副下外通道）一起进入混合器，之后四者混合，发生化学反应，发光检测器检测发光信号，测定3次，取峰值平均值进行定量，发光强度以计数表示。以水作为空白对照（已去除乙醇溶液对体系的影响），测定空白对照实验的发光强度为I₀，加入样品溶液后测定的发光强度为I，用以下公式计算抑制率。

a-鲁米诺溶液 b-载流（水） c-铁氰化钾溶液 d-样品溶液 P1、P2-蠕动泵 V-六通阀 F-流通池 W-废液池 D-发光检测器 PC-计算机 a-Luminol solution b-load flow (water) c-iron potassium cyanide solution d-sample solution P1 and P2-peristaltic pumps V-six-way injection valve F-circulating pool W-waste liquid pool D-luminescence detector PC-computer 图 1 系统的流动注射化学发光流路示意图Fig.1 Schematic diagram of flow injection chemilumin- escence system

抑制率＝(I₀－I)/I₀

以IC₅₀值来比较清除•OH能力的大小，以VC标准品作为阳性对照，相同条件下比较其与样品溶液的抑制率的大小。

为了筛选和寻找最佳的流动注射化学发光的条件，采用控制变量法考察了鲁米诺体系、铁氰化钾浓度、KOH浓度对体系的影响，确定鲁米诺的浓度50 μmol/L、铁氰化钾溶液浓度30 μmol/L、KOH浓度0.2 mol/L为最佳的流动注射化学发光的条件。

在浓度为50 μmol/L的鲁米诺溶液和30 μmol/L的铁氰化钾溶液以及0.2 mol/L KOH溶液的条件下，配制在1～100 μmol/L的一系列浓度的样品溶液，采用流动化学发光法测得总黄酮的抗氧化活性。结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 野菊花不同提取工艺总黄酮提取物的抗氧化活性 Table 1 Anti-oxidant effect of total flavonoids extracts obtained by three different extraction processes 提取工艺 IC50/(μg∙mL−1) 回流提取法 2.67 超声提取法 3.43 组织破碎提取法 5.13 VC 2.16

表 1 野菊花不同提取工艺总黄酮提取物的抗氧化活性 Table 1 Anti-oxidant effect of total flavonoids extracts obtained by three different extraction processes

前期研究^[8]中，野菊花药材RP-HPLC指纹图谱研究表明蒙花苷和木犀草素色谱峰是野菊花中黄酮类化合物的特征峰，且两者的量相对较高，可以作为野菊花总黄酮中的指标成分，蒙花苷和木犀草素具有多种药理功效，其中抗氧化活性是其主要功效之一。文献研究表明薄荷中含有的蒙花苷^[9]和淫羊藿中含有的木犀草素^[10]均具有抗氧化活性，故两者可以作为野菊花总黄酮中的目标成分及有效成分。前期研究^[7]以蒙花苷和木犀草素的量为指标，进行3种不同提取工艺的优选，表明加热回流提取法优于组织破碎提取法和超声提取法。综合前期化学成分研究结果和提取工艺研究结果，野菊花中总黄酮的抗氧化实验也同样采取了这3种提取工艺，结果表明加热回流提取法得到的总黄酮的量最高，且抗氧化活性最强，这一结果正好和前期根据黄酮类成化学成分进行工艺优选的结果相吻合，也再次说明了蒙花苷和木犀草素是野菊花药材中抗氧化活性的主要物质基础。

本研究以野菊花抗氧化活性为着手点，一方面采用经典回流提取法、超声提取法、组织破碎提取法考察了野菊花黄酮类成分的提取工艺，另一方面用流动化学发光法对野菊花中黄酮类成分进行抗氧化活性测定，采用野菊花中黄酮类成分的流动注射化学发光分析方法，考察了黄酮类成分和抗氧化活性的关系。研究结果表明，经典回流提取法得到的野菊花总黄酮的量最高，且抗氧化活性最强，说明野菊花中的总黄酮的量和抗氧化活性具有一致性，丰富了野菊花的基础研究，为野菊花药材的开发和应用提供参考。