2015, Vol. 46
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.20.015 |
2. 南京中医药大学 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心, 江苏 南京 210023;
3. 江苏省儿童呼吸疾病(中医药)重点实验室, 南京中医药大学中医儿科学研究所, 江苏 南京 210023
2. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China;
3. Jiangsu Key Laboratory of Pediatric Respiratory Disease, Institute of Pediatrics by Traditional Chinese Medicines, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China
香附四物汤出自清代梁廉夫《不知医必要》卷四，由当归、川芎、白芍、熟地、木香、香附、延胡索7味药组成，具有养血调血、行气止痛之功效，主治气滞血瘀所致痛经、月经不调等症[1, 2]，为行气化瘀代表方之一。
曾有文献报道[3, 4, 5]，对香附四物汤的物质基础进行研究，并对提取工艺进行了优化，制备了香附四物汤效应部位（BW）并提出阿魏酸、芍药苷、芍药苷内酯、普鲁托品、延胡索乙素、四氢非洲防己碱6个成分为BW的主要活性成分，其中阿魏酸主要来自当归和川芎，普鲁托品、延胡索乙素、四氢非洲防己碱主要来自延胡索。在此基础上将BW开发成外用制剂，研制了透皮贴剂，结果显示该制剂有较好的治疗效果[6]。但BW自身的透皮吸收性质还未见研究报道，本实验按照BW中6种活性成分的比例制备活性组分群，并考察了BW和活性组分群的体外透皮吸收性质。
1 仪器与材料TSQ Vantage型串联三重四级杆质谱仪，美国Thermo Fisher公司；Ultimate 3000型超高效液相色谱，美国Beckman Coulter公司；TK-12D透皮扩散试验仪，上海锴凯科技贸易有限公司；赛多利斯BSA-124S分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；TGL-20BR高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；S-210C酸度计，梅特勒公司；EP-ED超纯水机，南京易普易达科技发展有限公司；FD-1A-50冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；KH5200E型超声波清洗机，昆山禾创超声仪器有限公司；DKZ-2电热恒温振荡水浴槽，上海精宏实验设备有限公司。
当归为伞形科当归属植物当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels的干燥根、川芎为伞形科藁本属植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort. 的干燥根茎、白芍为毛茛科芍药属植物芍药Paeonia lactiflora Pall. 的干燥根、熟地黄为玄参科地黄属植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch. 的块根的炮制加工品、木香为菊科植物Aucklandia lappa Decne. 的干燥根、香附为莎草科莎草属植物莎草Cyperus rotundus L. 的干燥根茎、延胡索为罂粟科紫堇属植物延胡索Corydalis yanhusuo W. T. Wang的干燥块茎，药材饮片均购自安徽纪淞堂中药饮片有限公司，药材经南京中医药大学段金廒教授鉴定，药材质量均符合《中国药典》2010年版一部规定，标本收藏于南京中医药大学药学院药物制剂研究室。
对照品延胡索乙素（批号110726-201414，质量分数≥99.9%）、克拉霉素（质量分数≥98%，批号130558-201303）均购自中国食品药品检定研究院；对照品反式阿魏酸（批号20150112）、芍药内酯苷（批号20141128）、普鲁托品（批号20141209）、四氢非洲防己碱（批号20141124）、芍药苷（批号20141129），质量分数均≥98%，均购自南京春秋生物工程有限公司；D101大孔树脂，购自西安蓝晓科技有限公司；甲酸，色谱纯，Aladdin；乙腈、甲醇，色谱纯，Tedia；其余试剂均为分析纯。
雌性SD大鼠，200～220 g，购于上海杰思捷实验动物有限公司，合格证号SCXK（沪）2013-0006。
2 方法和结果 2.1 UPLC-MS/MS条件 2.1.1 液相条件色谱柱为Hibar HR C18柱（100 mm×2.1 mm，2 μm）；流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液。梯度洗脱：0～1 min，10%乙腈；1～5 min，10%～30%乙腈；5～6 min，30%～75%乙腈；6～8 min，75%～10%乙腈；8～11 min，10%乙腈；体积流量0.4 mL/min；进样体积4 μL；柱温35 ℃。
2.1.2 质谱条件离子源：ESI源；扫描方式：多反应监测（MRM）方式；气化管温度：450 ℃；毛细管温度：350 ℃；喷雾电压：负离子（3 500 V），正离子（3 184 V）。各成分的质谱参数见表 1。
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表 1 质谱参数 Table 1 Parameters of mass spectrometry |
分别取阿魏酸、芍药苷、芍药内酯苷、四氢非洲防己碱、普鲁托品、延胡索乙素对照品适量，精密称定，用甲醇溶解配制成对照品储备液；取适量的各成分储备液置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成混合对照品溶液，其中阿魏酸、芍药苷、芍药内酯苷、四氢非洲防己碱、普鲁托品、延胡索乙素的质量浓度分别为2 500.0、529.8、529.0、31.69、31.75、33.13 ng/mL。取上述混合对照品溶液用甲醇稀释成6份不同质量浓度的混标工作液。
精密称取克拉霉素对照品适量于量瓶中，用甲醇溶解配制成内标储备液，再取适量储备液用甲醇稀释至质量浓度为16.06 ng/mL的内标工作液。
精密量取混标工作液100 μL，加入100 μL内标工作液，混匀，19 000 r/min离心10 min。取上清液，按“2.1”项下UPLC-MS/MS方法进行分析。以被测化合物与内标的峰面积之比（Y）对质量浓度（X）进行线性回归，并按信噪比（S/N）＞10计算被测组分的定量限（LOQ）。结果分别为阿魏酸Y＝8.123×10−5 X－1.061×10−3，r＝0.999 4，线性范围78.13～2 500.00 ng/mL，定量限78.13 ng/mL；芍药苷Y＝1.804×10−4 X－1.505×10−3，r＝0.999 7，线性范围16.56～529.75 ng/mL，定量限16.56 ng/mL；芍药内酯苷Y＝1.888×10−4 X－3.602×10−4，r＝0.999 8，线性范围16.53～529.00 ng/mL，定量限16.53 ng/mL；四氢非洲防己碱Y＝0.337 7 X－0.156 3，r＝0.999 0，线性范围0.99～31.69 ng/mL，定量限0.99 ng/mL；普鲁托品Y＝0.210 3 X＋0.561 9，r＝0.997 7，线性范围0.99～31.75 ng/mL，定量限0.99 ng/mL；延胡索乙素Y＝0.299 0 X＋0.409 6，r＝0.999 4，线性范围1.04～33.13 ng/mL，定量限1.04 ng/mL。各成分均有良好的线性关系，r值均＞0.997。
2.3 方法学考察 2.3.1 精密度试验精密量取中质量浓度混标工作液（阿魏酸、芍药苷、芍药内酯苷、四氢非洲防己碱、普鲁托品、延胡索乙素的质量浓度分别为312.5、132.5、132.3、7.9、7.9、8.3 ng/mL）100 μL，加内标工作液100 μL，连续进样6次，以各成分质量分数为指标，计算阿魏酸、芍药苷、芍药内酯苷、四氢非洲防己碱、普鲁托品、延胡索乙素的RSD值分别为1.61%、0.94%、2.20%、2.53%、2.66%、1.83%，各成分精密度RSD≤2.66%，符合分析要求。
2.3.2 重复性试验按“2.4”项下方法制备BW供试液，平行6份，分别进样，以各成分质量分数为指标，计算阿魏酸、芍药苷、芍药内酯苷、四氢非洲防己碱、普鲁托品、延胡索乙素的RSD分别为2.87%、2.56%、2.02%、2.98%、1.51%、1.00%，重复性RSD≤2.98%，符合分析要求。
2.3.3 稳定性试验用“2.5.2”项下空白接收液配制BW混悬液，置于37 ℃水浴，分别于0、2、4、8、12 h分别取样，进行UPLC-MS/MS分析，以被测化合物质量浓度为指标，计算RSD，考察方法的稳定性。结果阿魏酸、芍药苷、芍药内酯苷、四氢非洲防己碱、普鲁托品、延胡索乙素的RSD分别为2.21%、1.68%、1.64%、3.51%、3.99%、2.27%，表明供试品溶液在12 h内稳定，各成分在空白皮肤接收液中12 h内稳定性RSD≤3.99%，均符合分析要求。
2.3.4 加样回收率试验取已测定的BW粉末适量，加入BW中各成分量的80%、100%、120%的对照品，各平行3份，用UPLC-MS/MS测定，计算加样回收率。结果各成分高、中、低回收率分别为阿魏酸（102.76±2.09）%、（97.11±6.52）%、（95.22±5.48）%，芍药苷（101.73±3.55）%、（97.06±2.08）%、（96.99±5.65）%，芍药内酯苷（103.65±1.13）%、（102.31±6.35）%、（96.32± 7.40）%、四氢非洲防己碱（99.18±1.40）%、（95.89± 2.14）%、（98.45±2.59）%，普鲁托品（102.89± 3.02）%、（102.02±3.26）%、（96.38±8.32）%，延胡索乙素（103.68±2.90）%、（98.97±2.67）%、（97.82±5.93）%，平均加样回收率95.22%～103.68%，符合分析要求。
2.3.5 方法专属性考察取空白皮肤接收液，按“2.5.3”项下方法处理（不加内标），作为空白样品；取已知质量浓度混标工作液100 μL，加入100 μL内标，获得混合对照样品；取已知浓度的BW溶液100 μL，加入100 μL内标，获得测试样品。按“2.1”项下UPLC-MS/MS方法进行测定，结果见图 1。皮肤接收液中的内源性物质不干扰各成分的测定，方法专属性良好。
 | 图 1 混合对照品＋内标 (A)、样品溶液＋内标 (B) 和空白皮肤接收液 (C) 中6个成分的MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of six compounds in mixed reference substances + internal standard (A), sample solution + internal standard (B), and blank receptor solution (C) |
取当归、川芎、白芍、熟地、木香、香附、延胡索（6∶3∶3∶8∶2∶3∶3）药材饮片2.1 kg，加10倍量水浸泡12 h后连续煎煮2次，合并2次药液，加热浓缩至生药质量浓度为1 g/mL，加入95%乙醇至药液达到80%酒精度，静置24 h后取上清液浓缩至无醇味，浓缩液经大孔吸附树脂以水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇梯度洗脱，收集60%乙醇洗脱部位（得率为0.366%），冷冻干燥后即得BW粉末。精密称取BW粉末适量，用50%甲醇超声溶解并定容，19 000 r/min离心10 min，精密量取上清液100 μL，加入100 μL内标，混匀，得BW供试液，用于UPLC-MS/MS分析。
经UPLC-MS/MS测定，BW中阿魏酸、芍药苷、芍药内酯苷、四氢非洲防己碱、普鲁托品、延胡索乙素的量分别为（4.65±0.11）%、（8.24±0.12）%、（3.00±0.09）%、（0.20±0.03）%、（0.24±0.01）%、（0.22±0.02）%（n＝3）。
2.5 体外透皮吸收研究 2.5.1 离体皮肤的制备取大鼠，麻醉后用刀片将腹部毛剔除干净，24 h后脱颈处死，剥离腹部皮肤，除去皮下血管及组织，于−20 ℃保存。实验前将皮肤自然解冻，用20%乙醇水溶液清洗干净备用。
2.5.2 供给液与接收液的制备（1）BW混悬液的制备：精密称取BW粉末适量置于量瓶，用20%乙醇水溶液超声溶解，最终BW质量浓度为2.06 mg/mL（阿魏酸、芍药苷、芍药苷内酯、四氢非洲防己碱、普鲁托品、延胡索乙素的质量浓度分别为72.0、155.4、59.2、4.1、4.1、4.2 μg/mL）。用pH计测定其pH值为4.04。
（2）活性组分群溶液的制备：精密称取阿魏酸、芍药苷、芍药苷内酯、四氢非洲防己碱、普鲁托品、延胡索乙素适量（按照BW部位中6个成分的比例），用20%乙醇水溶液溶解，定容到10 mL。再用20%乙醇水溶液稀释一定倍数。最终得到活性组分群溶液（阿魏酸、芍药苷、芍药苷内酯、四氢非洲防己碱、普鲁托品、延胡索乙素的质量浓度分别为72.0、155.4、59.2、4.1、4.1、4.2 μg/mL）。用pH计测定其pH值为4.89，为活性组分群A。同法配制活性组分群B，质量浓度与活性组分群A相同，溶剂中加入适量醋酸调节其pH值与BW混悬液（pH值为4.04）相同。
（3）空白接收液的制备：20%乙醇水溶液，使用前37 ℃预热并超声除去气泡。
2.5.3 体外透皮吸收实验采用改良Franz扩散池（扩散面积为3.14 cm2，接收室体积为7.0 mL）进行透皮实验，将离体腹部皮肤固定于扩散池上，角质层向上，接收室加入接收液，将装好皮肤与接收液的扩散池放入透皮扩散仪，37 ℃，500 r/min，平衡1 h。精密量取供给液2.0 mL于供给室，BW和活性组分群A、B各平行3份；在0、1、2、4、6、8、10、12 h分别吸取0.2 mL接收液，及时补充等温空白接收液。接收液样品用甲醇稀释，19 000 r/min离心10 min，精密量取上清液100 μL，加入内标100 μL，进行UPLC-MS/MS分析。
按公式Q＝(V总Cn＋∑V取Cn－1)/A[8]求算不同时间单位面积的药物累积透过量；按公式Tn＝AQn/Z总求算不同时间药物累积透过率，式中Q为单位面积累积透过量（μg/cm2），A为有效透皮吸收面积（cm2），V总为接收室体积（mL），V取为取样体积（mL），Cn为第n个取样点测得的接收液中药物质量浓度（μg/mL），Cn－1为第n－1个取样点测得的接收液中药物质量浓度（μg/mL），Tn为第n取样点的累积透过率，Qn为第n个取样点测得的单位面积累积透过量，Z总为供给室中加入的总药量。
6个成分的体外透皮吸收结果见图 2及表 2、3。图 2是各成分在不同时间点的累积透过率曲线。以各时间点单位面积累积透过量为纵坐标，时间（t）为横坐标作图，将曲线尾部直线部分数据进行线性回归，得到Q-t方程，直线的斜率为稳态流量［J，μg/(cm2·h)］，渗透系数（K）＝J/(3 600 C)，C＝Q/V总，结果见表 2。表 3是6个成分12 h的累积透过率的比较。
 | 图 2 活性组分群A、B和BW中6个成分累积透过率曲线 (n = 3)Fig.2 Accumulate transmittance curves of six ingredients in active ingredient groups A, B, and BW (n = 3) |
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表 2 体外透皮实验结果 Table 2 Results of in vitro transdermal experiment |
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表 3 主要活性成分12 h累积透过率 (x±s, n = 3) Table 3 Cumulative transmittance rate of main active ingredients for 12 h (x±s, n = 3) |
从图 2可以看出，供给液pH值不同，6个成分在活性组分群中的累积透过率不同，活性组分群A（pH值为4.89）与活性组分群B（pH值为4.04）相比，延胡索乙素和四氢非洲防己碱的累积透过率变高，阿魏酸的累积透过率变低。从表 3中也可以看出pH值影响6个成分的累积透过率，特别是延胡索乙素、四氢非洲防己碱12 h的累积透过率在活性组分群A与BW中有统计学差异（P＜0.05）。
将活性组分群与BW的pH值调节一致后，活性组分群B与BW中6个成分的累积透过率具有相同的顺序：阿魏酸＞四氢非洲防己碱＞延胡索乙素＞普鲁托品＞芍药苷≈芍药内酯苷，阿魏酸的累积透过率最高，T12为60%，而芍药苷和芍药内酯苷的T12在10%以下。表 2中，将活性组分群B和BW组6个活性成分的K值用单侧t检验，得到P值为0.499＞0.1，无统计学差异，进一步说明这6个成分在活性组分群B（pH 4.04）和BW中有相似的透皮行为，BW中其他成分对这6个成分的体外透皮吸收无影响。
2.6 主要活性成分饱和溶解度的测定取阿魏酸、芍药苷、芍药内酯苷、四氢非洲防己碱、普鲁托品、延胡索乙素对照品适量，置于西林瓶中，加入0.5 mL 20%乙醇水溶液，各平行3份。37 ℃水浴振荡12 h，12 000 r/min离心5 min后立即取上清液，用甲醇稀释一定倍数，UPLC-MS/MS进行测定，按“2.2”项回归方程求得饱和溶解度。结果见表 4。从表 4中可知，在体外透皮实验中，6个成分均满足漏槽条件。
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表 4 主要活性成分相关理化性质 (x±s, n = 3) Table 4 Physicochemical properties of main active ingredients (x±s, n = 3) |
张伯礼院士[9, 10]提出以组分配伍研究现代中药的观点，认为研究必须遵循“复杂-简单-复杂”的原则，借鉴现代药学的研究方法，发挥中医药理论优势，保持中药方剂的配伍特点，研制创新中药。在此基础上，苗明三等[11]对中药有效组分配伍研究进行探讨，认为中药有效组分配伍研究是开展中药现代研究的重要途径。本实验基于中药有效组分配伍的观点，首次以6个主要活性成分按照BW的比例制备活性组分群，将复杂的中药效应部位进行简化。体外透皮吸收实验结果显示，活性组分群B与BW中的6个成分透皮行为具有较高的一致性，BW中的其他成分对这6个成分的体外透皮吸收无影响。说明在透皮吸收研究中可以考虑用活性组分群B代替BW进行处方筛选优化。
本实验在体外透皮实验中发现pH值对BW的吸收行为具有显著影响，所以将活性组分群和BW的pH调至一致。因为6个成分pKa值从3.97～12.89，如阿魏酸pKa 3.97，3个生物碱的pKa在7.78～8.40，芍药苷和芍药内酯苷的pKa＞12，溶液pH值从4.04变为4.89，会影响各成分的解离程度，从而会影响其透皮行为，且影响的程度不同。对阿魏酸和3个生物碱的影响较大，而对pKa＞12的芍药苷和芍药内酯苷的影响不显著。
对在透皮制剂的处方优化和促渗剂筛选中，往往会忽视pH的影响，如油酸、丙二醇、氮酮等经常作为促渗剂[13, 14]，很明显其中油酸（pKa 4.69）具有酸性，会影响基质的pH，从而影响药物的透皮吸收效果。在本实验中，由于6个成分的pKa和Mw差异很大，且pH对这6个成分的透皮行为的影响不同，所以，还要通过药效实验进一步来确定制剂的最佳pH值。
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