黄芪属被子植物门、双子叶植物纲、原始花被亚纲、蔷薇目、豆科植物。我国使用的药用黄芪有蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. 的干燥根。黄芪是临床常用品种之一，《中国药典》2015年版记载黄芪具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌等功效^[1]。膜荚黄芪主要含有的化学成分包括多糖、皂苷、黄酮、氨基酸和微量元素等^[2]。临床和实验室研究证实黄芪具有显著的免疫调节功能和抗肿瘤等作用^{[3, 4, 5, 6, 7]}。虽然膜荚黄芪全基因组学尚未被解码，但其全转录组和表达序列标志（expressed sequence tag，EST）已完成检测^[8]。742 721个高质量序列读数中包括了已知的9 893个独特序列。这将有利于今后黄芪的生物合成和生物化学改良研究，同时黄芪的代谢和生物合成通路也被明确。

微小RNA（microRNA、miRNA）是一类小的内源性非编码RNA。它们来源于miRNA初级转录产物（primary transcripts miRNA，pri-miRNAs），具有1个发夹型结构^[9]。在植物中，miRNA是通过直接裂解转录物调节靶基因^{[10, 11]}或抑制其转录水平^[12]。miRNA对植物的生长发育和逆境胁迫（stress responses）起着重要的调节作用^[13]。赵春丽等^[14]也研究了地黄栽培种85-8的miRNA对地黄生长发育、逆境胁迫响应和代谢调控的影响。Wu等^[15]采用高通量测序技术对新鲜人参的各部位确定了miRNA谱以及靶基因的预测。

自从首次发现植物拟南芥miRNA后，miRNA的研究飞速发展^[16]。到目前为止，已确定了206种24 521个miRNA基因，根据miRNA基因库（miRBsse 21）资料显示，经计算机分析处理已明确30 424个成熟miRNA序列^[17]。但目前尚未见对热力学处理后中药饮片miRNA图谱研究的文献报道。

中药饮片是植物药原材料经干燥炮制加工后的特殊药品，一般经中医师处方后煎煮饮用。本课题组以黄芪饮片为实验材料，试图建立中药饮片经煎煮后miRNA谱，为今后研究潜在的调节靶基因的miRNA奠定基础。

黄芪饮片由养和堂中药饮片公司提供（批号140924），10 g/袋，经上海中医药大学附属上海市中西医结合医院药剂科主管药师王嵩鉴定为生黄芪，基原植物为豆科黄芪属植物膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.。黄芪产地为甘肃省陇西县。

参照文献方法^[18]，用微波炉（功率325 W）加热2 min，干燥灭菌，然后用灭菌注射用水100 mL浸泡30 min。将黄芪浸泡溶液置微波炉加热（功率525 W）6 min，移去黄芪，得到黄芪煎煮液，冷却备用。

将冷却后的黄芪煎煮液置入超滤容器装置（产品号VFPPES122250，美国Membrane Solutions LLC公司，该装置滤膜孔径为0.22 μm），收集滤液1 mL于无菌干燥试管。

收集滤液以1∶9体积加入Trizol试剂（美国Invitrogen公司），并立即用聚乙烯薄膜覆盖封口，置−20 ℃保存待测。

使用NanoDrop ND- 1000设备纯化和确定黄芪煎煮液总RNA的量，并建立样本质量控制报告。

将样本总RNA用于小分子RNA文库构建。经纯化后的小分子RNA分别经5’和3’接头连接后经RT-PCR扩增，形成小分子RNA的cDNA文库，直接用于深度测序。长度控制在130～150 bp，相当于15～30核苷酸（nucleotide，nt）小分子RNA^[19]。RNA深度测序使用Agilent 2100 Bioanalyzer设备，由康成生物技术有限公司完成。

采用美国Agilent公司llumina HiSeq 2000测序仪测序得15～30 nt序列，通过去接头、去低质量、去污染、统计序列长度分布等过程完成初级分析^[20]。将初级分析得到的序列进行分类注释，以获得样品中包含的各组分及表达量信息。剩余的小分子RNA序列与miRNA数据库（miRBase 21）所有植物的miRNA序列进行比对，得到样品中已知miRNA的量、首位点碱基分布及表达丰度等信息。

使用novoalign 10.1软件（Novocraft Technologies Sdn Bhd）对已知所有的植物miRNA序列进行对比，确定miRNA特征。通过前体序列分析，确定其茎环结构和成熟miRNA序列。后期采用手工方法查找经热力学处理后的黄芪所含miRNA，并与miRNA数据库（miRBase 21）标准序列比对差异，建立经热力学处理后黄芪饮片的miRNA谱。

经Agilent 2100 Bioanalyzer对黄芪煎煮液样本的RNA深度测序，获得初步描述性结果。黄芪煎煮液深度测序后可得到9 931 049读数，这些读数代表了4 606 460种类型的小分子RNA片段，其中成熟miRNA序列为24 994条。序列长度分布和读数见表 1。小分子RNA分布呈斜率直线分布，各长度类型随核苷酸增长而减少。长度为16～20 nt读数为3 875 742，占总数的48.12%，为主要部分。这类小分子RNA经常被视为小干扰性RNA（small interfere RNA，siRNA）。其中16 nt占12.83%，17 nt占12.51%。而长度在20～24 nt占40.39%。20～24 nt长度的RNA往往被认为主要是miRNA。本次研究发现小分子RNA数量上高于可能的miRNA。24～30 nt所占比例较低。

表 1(Table 1)

表 1 黄芪小分子 RNA 种类分析(长度分布和读数) Table 1 Category analysis on miRNA from A. membranaceus (length distribution and reading) 去接头修剪后 读数长度/nt 全部读数 去接头修剪后 读数长度/nt 全部读数 16 497 115 24 206 146 17 484 864 25 164 923 18 446 749 26 115 767 19 436 296 27 88 301 20 394 291 28 60 094 21 371 321 29 41 130 22 326 557 30 25 141 23 267 047

表 1 黄芪小分子 RNA 种类分析(长度分布和读数) Table 1 Category analysis on miRNA from A. membranaceus (length distribution and reading)

使用Novoalign10.1软件对黄芪煎煮液与已知所有植物miRNA序列进行对比，仅得到1个豆科MIR6300保守序列。鉴于黄芪煎煮液是经历了干燥、储存、加热和微波等热力学处理后的标本，本实验采用了手工查找对比方法，研究发现有510种前体miRNA序列，分别属于23个家族。根据文献报道^[21]设置读数阈值为10，其中读数超过10的有11个序列（表 2）。对高丰度表达的miRNA继续进行分析，研究表明其中存在46个保守或非保守或残缺不全的miRNA序列，这些miRNA的长度在15～21 nt，大多短于miRBase 21同名序列。它们在大豆

表 2(Table 2)

表 2 前体miRNA主要种类 (读数＞10) 和读数 Table 2 Main categories and reading of miRNAs precursors (reading > 10) miRNA前体种类 读数 miRNA前体种类 读数 miR8175 25 miR2916 254 miR5054 11 miR894 16 miR5368 23 miR398 17 miR6300 35 miR1103 34 miR9728 11 miR398b 17 miR2592b 19

表 2 前体miRNA主要种类 (读数＞10) 和读数 Table 2 Main categories and reading of miRNAs precursors (reading > 10)

Glycine max Merr.、拟南芥Arabidopsis thaliana Heynh. 和水稻Oryza sativa Watt. 等植物上均存在进化上的保守性，以豆科类miRNA种类表达为最多见（表 3）。其中高度保守并耐高温和微波等处理的仅1个miRNA（tcc-miR396d）。而新发现的非保守并耐高温和微波等处理的miRNA有9个序列，包括miR166i、miR396和miR5077（表 4）。其中miR396家族序列包含了7个相同序列（mdm-miR396e、mdm-miR396f、mdm-miR396g、pab-miR396b、pab-miR396c、ptc-miR396f、ptc-miR396g-5p）。

表 3(Table 3)

表 3 黄芪miRNA谱及与miRBase 21数据库的对比 Table 3 Profile of miRNAs identified from A. membranaceus and comparison with miRBase 21 database miRNA名称 核苷酸序列 (5’→3’) nt miRBase 21数据库核苷酸序列 (5’→3’) nt ata-miR5168-5p GUUGUCGUCUGGUUCA 16 GGGUUGUUGUCUGGUUCAAGG 21 ath-miR401 AACUGGUGUCGACCG 15 CGAAACUGGUGUCGACCGACA 21 ath-miR5660 CAGGAGGUUAGUGCAAUG 18 CAGGUGGUUAGUGCAAUGGAA 21 ath-MIR8175 CCCCGGCAGCGGCGCC 16 GAUCCCCGGCAACGGCGCCA 21 bdi-miR5054 CCCCACGGUGGGCGCC 16 UCCCCACGGUCGGCGCCA 18 bdi-miR7735-3p CGCCGGUCGGAGCCAC 16 CCGGUCGGAGCCAAGAGACGCGGC 24 bdi-miR7777-5p.1 UGGGUAGAACUGCCUCU 17 CUUUGGUUGGGUAGAACUACC 21 cca-miR6117 CCGGGUUGAAGACAUU 16 GGUUAGGUUGAUCGGGUUGAAGAC 24 cme-miR166i UCUCGGACCAGGCUUCAUUCU 21 UCGGACCAGGCUUCAUUCUC 20 cme-miR396e UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20 UUCCACGGCUUUCUUGAACUG 21 cpa-miR8155 CCUGGCUCUGAUACC 15 UAACCUGGCUCUGAUACCA 19 csi-miR3953 UUCUGUAAGCCGUCGA 16 UUGAGUUCUGCAAGCCGUCGA 21 gma-miR171a UCGUUGAGCCGUGCCA 16 UGAGCCGUGCCAAUAUCACGA 21 gma-miR171i-3p UUCGUUGAGCCGUGCC 16 UUGAGCCGUGCCAAUAUCACG 21 gma-miR4995 GGCAGUGGCUUGGUU 15 AGGCAGUGGCUUGGUUAAGGG 21 gma-miR5368 AGGGACAGUGUCAGGUAG 18 GGACAGUCUCAGGUAGACA 19 gma-miR5783 CGGAGACGACGGCGGGG 17 GACGACGACGGGGAGGACGCGC 22 gma-miR6300 UCGUUGUAGUAUAGUGGUAAG 21 GUCGUUGUAGUAUAGUGG 18 gma-miR862a CUUUGAAGGAAUUAGA 16 UGCUGGAUGUCUUUGAAGGAAU 21 gma-miR9728 ACCCGGAGAACUGAAACA 18 CGCAGAACUGAAACAAGUUGA 21 gma-miR9728 ACCCGGAGAACUGAAACA 18 CGCAGAACUGAAACAAGUUGA 21 hbr-miR6173 UAAACGAUGGAUACU 15 AGCCGUAAACGAUGGAUACU 20 lus-miR171i UUCGUUGAGCCGUGCC 16 UUGAGCCGUGCCAAUAUCACG 21 mdm-miR396f UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20 UUCCACGGCUUUCUUGAACUG 21 mdm-miR396g UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20 UUCCACGGCUUUCUUGAACUG 21 mtr-miR2603 GUCCCUGCCCUUUGUA 16 UUUGGUAUUGGUCCCUGCACUU 22 mtr-miR7696a-3p AUGAGAACUUGAAGGACC 18 UUGAAUUAUGAGAACUUGAAG 21 osa-miR5072 CCCCAGCGGAGUCGCC 16 CGAUUCCCCAGCGGAGUCGCCA 22 osa-miR5077 GUUCACGUCGGGUUCACCA 19 GUUCGCGUCGGGUUCACCA 19 osa-miR5083 CUACAAUUAUCUGACC 16 AGACUACAAUUAUCUGAUCA 20 osa-miR5800 CGGAACGGCUGCUUC 15 CCCGGCUAUCGGAACGGCUGC 21 pab-miR3711 GGCGCUAGAAGGAGGGC 17 UGGCGCUAGAAGGAGGGCCU 20 pab-miR396b UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20 UUCCACGGCUUUCUUGAACUU 21 pab-miR396c UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20 UUCCACGGCUUUCUUGAACUU 21 peu-miR2916 UUGGGGGCUCGAAGACGAUC 20 UGGGGACUCGAAGACGAUCAUAU 23 ppe-miR1511-3p CCUGGCUCUGAUACC 15 ACCUGGCUCUGAUACCAUAAC 21 ppt-miR894 UUCACGUCAGGUUCACC 17 CGUUUCACGUCGGGUUCACC 20 ptc-miR396f UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20 UUCCACGGCUUUCUUGAACUG 21 ptc-miR396g-5p UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20 UUCCACGGCUUUCUUGAACUU 21 rgl-miR5139 CCUGGCUCUGAUACC 15 AAACCUGGCUCUGAUACCA 19 smo-miR396 UUCCACGGCUUUCUUG 16 UUCCACGGCUUUCUUGAACC 20 tcc-miR160a GUUCUCCCUGGCUCCCUGA 19 UGCCUGGCUCCCUGAAUGCCA 21 tcc-miR396d UUCCACGGCUUUCUUGAACUU 21 UUCCACGGCUUUCUUGAACUU 21 vvi-miR160b GUUCUCCCUGGCUCCCUGA 19 UGCCUGGCUCCCUGAAUGCCAUC 23 zma-miR398b-5p CGGGGGACGGACUGGGAA 18 GGGGCGGACUGGGAACACAUG 21 miRNA名称前缀缩写：ata-山羊草，ath-拟南芥，bdi-二穗短柄草，cca-刺菜蓟，cme-香瓜，cpa-番木瓜，csi-甜柳橙，gma-大豆，hbr-巴西橡胶树，lus-胡麻，mdm-苹果，mtr-蒺藜状苜蓿，osa-水稻，pab-挪威云杉，peu-胡杨，ppe-桃花，ppt-苔藓，ptc-杨树，rgl-地黄，smo-江南卷柏，tcc-可可树，vvi-葡萄，zma-玉米，下同 miRNA name prefix abbreviation: ata-Aegilops tauschii, ath-Arabidopsis thaliana, bdi-Brachypodium distachyon, cca-Cynara cardunculus, cme-Cucumis melo, cpa-Carica papaya, csi-Citrus sinensis, gma-Glycine max, hbr-Hevea brasiliensis, lus-Linum usitatissimum, mdm-Malus domestica, mtr-Medicago truncatula, osa-Oryza sativa, pab-Picea abies, peu-Populus euphratica, ppe-Prunus persica, ppt-Physcomitrella patens, ptc-Populus trichocarpa, rgl-Rehmannia glutinosa, smo-Selaginella moellendorffii, tcc-Theobroma cacao, vvi-Vitis vinifera, zma-Zea mays, same as below

表 3 黄芪miRNA谱及与miRBase 21数据库的对比 Table 3 Profile of miRNAs identified from A. membranaceus and comparison with miRBase 21 database

表 4(Table 4)

表 4 黄芪中新发现的非保守的miRNA种类 Table 4 ovel non-conserved miRNAs identified from A. membranaceus miRNA名称 核苷酸序列 (5’→3’) nt cme-miR166i UCUCGGACCAGGCUUCAUUCU 21 cme-miR396e UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20 mdm-miR396f UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20 mdm-miR396g UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20 osa-miR5077 GUUCACGUCGGGUUCACCA 19 pab-miR396b UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20 pab-miR396c UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20 ptc-miR396f UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20 ptc-miR396g-5p UUCCACGGCUUUCUUGAACU 20

表 4 黄芪中新发现的非保守的miRNA种类 Table 4 ovel non-conserved miRNAs identified from A. membranaceus

文献报道^[22]，根据经热力学处理后核苷酸结构特性与siRNA靶基因识别功能的相互作用，将siRNA分为3类，其中I类siRNA分子具有最强烈的基因沉默效应，I类siRNA的鉴别标准为3’端1～7核苷肽位点（种子区域）上有4～7个A或U [（A＋U）≥57%]。结果显示，黄芪煎煮液有5个miRNA序列符合I类siRNA结构标准（表 3），分别为miR5139、miR6173、miR396、miR8155和miR166i。其中miR396家族序列包含了8个相同序列（mdm-miR396e、mdm-miR396f、mdm-miR396g、pab-miR396b、pab-miR396c、ptc-miR396f、ptc-miR396g-5p、ttc-miR396d）。同时除了这类miRNA与保守和新的非保守miRNA序列有部分重叠之外，均显示了经热力学处理后明显miRNA链的断裂，以5’端的断裂为主，但种子区域呈现了高度稳定（表 5）。

表 5(Table 5)

表 5 经热力学处理的黄芪煎煮液I类siRNA序列与已知数据库的比较 Table 5 Comparison on class I siRNA sequences from extract of A. membranaceus after thermodynamic treatment and known miRBase 21 database miRNA名称 miRBase 21数据库序列与检测 所获得的序列比较 (5’→3’) miRBase 21 cpa-miRNA8155 UAACCUGGCUCUGAUACCA CCUGGCUCUGAUACC miRBase 21 hbr-miR6173 AGCCGUAAACGAUGGAUACU UAAACGAUGGAUACU miRBase 21 rgl-miR5139 AAACCUGGCUCUGAUACCA CCUGGCUCUGAUACC miRBase 21 cme-miR166i UCGGACCAGGCUUCAUUCUC UCUCGGACCAGGCUUCAUUCU miRBase 21 UUCCACGGCUUUCUUGAACUG miR-396家族 UUCCACGGCUUUCUUGAACU 方框内为种子区域 Boxes indicate seed region

表 5 经热力学处理的黄芪煎煮液I类siRNA序列与已知数据库的比较 Table 5 Comparison on class I siRNA sequences from extract of A. membranaceus after thermodynamic treatment and known miRBase 21 database

黄芪是中医最常用的植物药之一，以往的研究大多在其化学成分方面进行探索。黄芪的化学成分包括皂苷、多糖和黄酮等物质^[23]，但提纯的单一成分在实验研究和临床治疗中均未很好显现其疗效。即使在其他中药研究中，单一化学成分能证明其有效作用部位的也很少，如青蒿素和三氧化二砷等，而植物药的多靶点的治疗理论尚缺乏足够的依据。

绝大多数真核细胞都具有通过20～24 nt RNA实施基因转录沉默的保守机制，miRNA是小分子RNA中的一类重要的内源性分子。随着非编码小分子RNA在基因沉默中作用的明确和高通量测序技术的发展，使得生物界纷纷将研究重点从DNA基因组学转入表观遗传学。随着miRNA在人类各种疾病研究的进展，已将大量的特异性miRNA作为生物标记物，并期待miRNA可直接用于疾病治疗。

不同于农业部门对miRNA的研究，医学研究的目的主要是针对人类疾病的防治。中药原材料经加工、销售、储存、配制和煎煮等直至患者服用具有相当复杂漫长的过程，与一般植物miRNA分析研究目的和方法存在很大差异，植物miRNA分析的主要目的是观察植物进化过程、便于增产改良以及对抗逆境胁迫等，均采用新鲜植物的各个部位作为观察研究对象。而中药饮片miRNA研究目的是考虑在热力学作用下小分子RNA的稳定性。

中药主要包括植物药、动物药和矿物药等种类，在临床绝大部分中医处方中使用药物仍以植物药为主。从人体口服吸收药物角度考虑，除了化学成分外并不能排除吸收植物小分子RNA的可能性，虽然这可能涉及跨物种（cross-kingdom）遗传影响，但也不是没有例外^[24]。本研究的目的在于从实际使用的植物药即中药煎煮后服用的状况中明确小分子RNA的存在，便于今后寻找可能的靶基因，以探索黄芪的药理作用机制。

本研究首先检测到了黄芪经炮制、加热和微波作用后仍存在丰富的长度不等的15～30 nt小分子RNA。与其他中药miRNA研究不同^{[14, 15]}，本研究使用的黄芪饮片煎煮液不是新鲜植物标本，是经炮制、储存、加热和微波等处理加工的，尤其经热力学和微波的物理处理，小分子RNA链的断裂应在意料之中，因此16～20 nt所占比例最高。黄芪煎煮液经高通量测序后呈现丰富的小分子RNA数量，与其他研究无可比性，同时经文献检索也未发现国内外有同类实验研究。

黄芪煎煮液标本经高通量测序后，所得数据由计算机软件进行生物信息学分析，仅得到豆科类MIR6300保守序列，经多家基因和生物信息技术公司分析，均认为测序所得结果无法进行现有计算机软件生物信息学分析，因而改为手工对比分析。从510种成熟miRNA序列中检索出46个高丰度表达的miRNA，这些miRNA在大豆、拟南芥和水稻等植物上均存在进化上的保守性，以豆科类miRNA种类表达为最多见（表 1），符合黄芪植物种类品系特征。其中能耐受高温、干燥和微波等物理条件的仅miR396家族，呈高度保守。另发现新的非保守的miRNA 9个（表 2），除了miR166i和miR5077外，均为miRNA396家族成员，大部分序列仅1个核苷酸与miRBase 21数据库有差异。同时核苷酸长度均在19～21 nt。结果表明，在黄芪煎煮液中最能耐受热力学条件的大部分为miR396家族成员。

siRNA在RNA诱导静默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）中的作用可能存在2种结果：一种是导致RNA静默；另一种导致脱靶效应^[25]。热力学决定了小分子RNA介导的基因沉默的干扰活性，其决定因素在于种子区域的保守性，即siRNA的种子区域与miRNA经Watson-Crick碱基配对的稳定性。可将siRNA分为3类：I类siRNA有强大的基因沉默作用，它在3’→5’ 1～7个核苷酸位置上有4～7个A或U（腺嘌呤/尿嘧啶），也就是在7个核苷酸位点上A＋U的比例≥57%，同时在19个核苷酸位点上为G或C（鸟嘌呤/胞嘧啶）。III类siRNA很少有基因沉默作用，它在3’→5’ 1～7个核苷酸位置上以G或C为主。II类siRNA的基因沉默作用介于I类和III类之间^[22]。文献报道^[26]，经热力学处理的在5’端不稳定的小分子RNA链十分有利于进入并保留在RISC中。本实验研究发现，有12个小分子RNA序列符合I类siRNA（表 3）。I类siRNA在基因沉默机制中作用最强，其最有可能成为具有药用价值的物质基础分子。

虽然本实验得到了以上探索性的结果，但未将新鲜黄芪药材作为对照分析样本，因此在确定其物种的表观遗传学特征和基因保守性方面有待进一步研究。本实验使用微波加热技术的目的在于实验的可重复性、可操作性和规范性，以模拟常规中药煎制方法获取研究样本，探索真实的能进入人体的黄芪小分子RNA的种类，为进一步探索黄芪在多种疾病治疗中miRNA的功效和作用机制提供参考性基础数据。

利用基因高通量深度测序方法，首次明确黄芪饮片煎煮液中含有大量小分子RNA，并确定其miRNA谱。经干燥、炮制、加热和微波处理，仍存在保守或非保守的miRNA，同时存在12个I类siRNA分子，黄芪中miR396家族对热力学最稳定。黄芪中小分子RNA的药用价值有待进一步研究探索。

志谢：本实验得到上海交通大学附属第一人民医院检验中心谢匡成老师理论方面的指导。