金沙藤Lygodii Herba为海金沙科植物海金沙Lygodium japonicum (Thunb.) Sw.、小叶海金沙L. microphyllum (Cav.) R. Br. 或曲轴海金沙L. flexuosum (L.) Sw. 的干燥地上部分，本品始载于《证类本草》，李时珍谓：“生山林下，茎细如线，引于竹木上，叶背多皱纹，皱处有沙子，壮如蒲黄粉，黄赤色，不开花，细根坚强，其沙及草皆可入药”^{[1, 2]}。现收载于《广西中药材标准》《广西瑶药质量标准》中，具有清热解毒、利水通淋的功能^[3]。现代研究表明金沙藤富含有机酸类、酚类和黄酮类等多种化合物^{[4, 5]}。系统研究发现，以绿原酸、咖啡酸为代表的苯丙烯酸类为其主要成分，金沙藤中咖啡酸的测定方法已有报道^[6]，本实验建立了其中绿原酸、咖啡酸和p-香豆酰葡萄糖3个主要成分同时测定方法，为更全面地评价金沙藤药材及相关提取物的质量奠定基础。

金沙藤采自广西桂林地区（批号分别为140803、140804、140805、141201、141202、141203），经桂林三金药业股份有限公司钟小清高级工程师鉴定为海金沙Lygodium japonicum (Thunb.) Sw. 的干燥地上部分，药材留样存放于桂林三金药业股份有限公司药物研究所标本室。绿原酸、咖啡酸对照品购自中国食品药品检定研究院，p-香豆酰葡萄糖对照品为自制（质量分数均大于98%）。甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

Waters 2695高效液相色谱仪，DAD二极管阵列检测器（Waters，美国），Empower工作站，BuG-40超声仪（必能信，上海Branson）。

色谱柱为Phenomenex C_l8（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-乙腈-1%冰醋酸（5∶5∶90）；体积流量1 mL/min；p-香豆酰葡萄糖、绿原酸、咖啡酸检测波长为325 nm；柱温35 ℃；在上述色谱条件下，p-香豆酰葡萄糖、绿原酸、咖啡酸对应的保留时间为20.3、23.2、26.6 min，分离度良好，色谱图见图 1。

1-p-香豆酰葡萄糖 2-绿原酸 3-咖啡酸 1-6-O-p-coumaroyl-D-glucopyranose 2-chlorogenic acid 3-caffeic acid 图 1 混合对照品 (A) 及金沙藤 (B) 的HPLC色谱图Fig.1 HPLCof mixed reference substances (A) and Lygodii Herba (B)

分别精密称取25 ℃干燥至恒定质量的p-香豆酰葡萄糖、绿原酸、咖啡酸对照品适量，置棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液（质量浓度分别为1.019、0.921、0.402 mg/mL）。分别吸取p-香豆酰葡萄糖、绿原酸、咖啡酸的储备液0.5、2.0、0.8 mL移至10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为混合对照品溶液。

精密称取金沙藤粉末（过2号筛）约1.5 g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，称定质量，加甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，作为供试品溶液。

精密吸取混合对照品溶液2、4、6、8、10、15 μL注入液相色谱仪，以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得绿原酸回归方程为 Y＝1.110×10⁶ X＋1.047×10⁶，r＝0.999 3；咖啡酸回归方程为Y＝2.451×10⁶ X＋3.477×10⁶，r＝0.999 3；p-香豆酰葡萄糖回归方程为Y＝1.057×10⁶ X＋3.248×10⁶，r＝0.999 3。结果表明，绿原酸、咖啡酸和p-香豆酰葡萄糖分别在0.368～2.760、0.064～0.480和0.102～0.765 μg与峰面积呈良好的线性关系。

精密称取金沙藤粉末（批号 140803，过2号筛）约1.5 g，制备供试品溶液，进样10 μL，重复进样6次，测定绿原酸、咖啡酸、p-香豆酰葡萄糖的峰面积，分别计算质量分数，测得质量分数的RSD分别为0.03%、0.12%、0.13%。

精密称取金沙藤粉末（批号 140803，过2号筛）约1.5 g，制备供试品溶液，室温下放置，分别于0、4、8、16、24、48 h精密吸取供试品溶液10 μL，测定绿原酸、咖啡酸、p-香豆酰葡萄糖的峰面积值，并分别计算质量分数，测得其质量分数的RSD值分别为1.03%、1.12%、0.41%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

精密称取同一批金沙藤粉末（批号 140803，过2号筛）6份，分别制备供试品溶液，分别测定并计算绿原酸、咖啡酸、p-香豆酰葡萄糖的量，测得样品中绿原酸、咖啡酸、p-香豆酰葡萄糖平均质量分数分别为0.076%、0.015%、0.200%，RSD分别为0.47%、1.90%、2.45%，结果表明该方法重复性良好。

精密称取已测定的金沙藤粉末（批号 140803，过2号筛）0.75 g，平行6份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入p-香豆酰葡萄糖（1.019 mg/mL）对照品溶液1.5 mL、绿原酸（0.921 mg/mL）对照品溶液0.6 mL和咖啡酸（0.402 mg/mL）对照品溶液0.3 mL，制备供试品溶液，测定并计算加样回收率，绿原酸、咖啡酸、p-香豆酰葡萄糖的平均回收率分别为101.48%、99.56%、101.73%，RSD分别为1.44%、0.92%、1.62%。

取各批次金沙藤粉末（过2号筛）1.5 g，各2份，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别测定其中绿原酸、咖啡酸、p-香豆酰葡萄糖的量，结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 金沙藤中绿原酸、咖啡酸和p-香豆酰葡萄糖的测定 (n＝3) Table 1 Determination of chlorogenic acid,caffeic acid,and 6-O-p-coumaroyl-D-glucopyranose in Lygodii Herba (n＝3) 批号 质量分数/(mg·g-1) 绿原酸 咖啡酸 p-香豆酰葡萄糖 140803 0.76 0.15 2.00 140804 0.55 0.09 1.35 140805 1.02 0.21 2.11 141201 0.84 0.22 1.69 141202 0.69 0.09 1.31 141203 0.91 0.18 1.87

表 1 金沙藤中绿原酸、咖啡酸和p-香豆酰葡萄糖的测定 (n＝3) Table 1 Determination of chlorogenic acid,caffeic acid,and 6-O-p-coumaroyl-D-glucopyranose in Lygodii Herba (n＝3)

不同批次金沙藤均能检测出3个目标成分，相比而言，绿原酸、p-香豆酰葡萄糖的量较高，可以优先考虑作为金沙藤质量控制指标。

制备供试品溶液时，考察了不同提取溶剂，发现水、乙醇虽能较好地提取相关成分，但同时提取较多杂质成分，干扰目标成分的检测，故选择甲醇作为提取溶剂，经简单超声处理即能有效地提取目标成分。

尝试用甲醇-乙腈-水作为流动相，发现绿原酸、咖啡酸峰形拖尾。流动相中加入适量冰醋酸，可有效改善拖尾现象。经不同流动相配比，发现以甲醇-乙腈-1%冰醋酸（5∶5∶90）作为流动相，目标峰的分离度良好、保留时间合适。

分别取绿原酸、咖啡酸和p-香豆酰葡萄糖对照品溶液，在200～400 nm进行紫外光谱扫描，结果绿原酸最大吸收在219、325 nm，咖啡酸最大吸收在221、322 nm，p-香豆酰葡萄糖最大吸收在228、314 nm，为确保不同成分均有较高灵敏度和减少杂质干扰，最终选择325 nm作为检测波长，对3种成分可以同时进行有效测定。