糖尿病（diabetic mellitus，DM）是一种常见的、严重危及人类健康的全身性慢性代谢性疾病，且糖尿病的发生、发展往往伴随多种并发症^[1]。其中高尿酸血症是一种嘌呤代谢障碍性疾病，并与糖尿病相互影响，糖尿病可导致高尿酸血症，高尿酸血症可诱发Ⅱ型糖尿病^[2]。目前，高尿酸血症的发病逐年上升且呈低龄化趋势。研究和开发高效低毒作用的糖代谢酶调节剂来有效预防和治疗糖尿病及其并发症是现代医药学及生命科学界重点和难点研究课题之一。中药复方在治疗糖尿病等慢性疾病方面的研究报道很多，也显示其独特的优势，如降血糖作用温和持久、疗效稳定、副作用小等。龙砂颗粒为成都中医药大学附属医院在研的一种颗粒剂，由黄芩、苍术、黄柏、黄连等9味中药组成，具有清热利湿、活血祛毒的功效。处方原为该医院临床经验方，主要用于糖尿病合并高尿酸血症的治疗，经长期临床使用效果良好。汤剂虽能临证加减，但对于慢性病患者存在配方、煎煮、携带不方便等问题，故而将该方进行了制剂学研究，制备为颗粒剂^[3]。方中黄芩、黄连和黄柏是临床中的常用配伍药对，所含主要成分黄芩苷、黄芩素、盐酸小檗碱、黄柏碱、芦丁、槲皮素等不仅可以降低血糖，还能改善糖尿病并发症^{[4, 5, 6]}，且临床上运用苍术，具有健脾、燥湿、解郁、辟秽的功效，与黄柏组成二妙系列方治疗高尿酸血症取得了明显的疗效^[7]。研究表明，中药降糖活性成分主要有生物碱类、黄酮类、皂苷类、酚类等^{[8, 9]}。本研究通过建立一种双波长RP-HPLC梯度洗脱法同时测定黄柏碱、芦丁、黄芩苷、盐酸小檗碱、槲皮素、黄芩素、苍术素7种成分，以期更好地控制龙砂颗粒的质量，确保临床用药安全有效。

Waters-2695型高效液相色谱仪，美国Waters公司，包括四元泵、在线脱气机、自动进样器、2996型二极管阵列检测器和Empower色谱工作站；KQ5200E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；Mettler AE240S型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

黄柏碱、芦丁、黄芩苷、盐酸小檗碱、黄芩素、苍术素对照品，均购于成都普菲德生物技术有限公司，批号分别为121120、121023、130829、121128、130119、130216，质量分数均大于98%；槲皮素对照品，四川省维克奇生物技术有限公司，批号为110627，质量分数大于98%。色谱纯乙腈，欧森巴克；分析纯甲醇、磷酸，成都市科龙化工试剂厂；水为纯化水。龙砂颗粒样品，批号130901、130902、130903、131201、131202、131203；规格15 g/袋，由成都中医药大学附属医院制剂室制备。

Kromasil C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.02%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～8 min，15%～25%乙腈；8～10 min，25%～30%乙腈；10～25 min，30%～35%乙腈；25～30 min，35%～73%乙腈；30～45 min，73%～90%乙腈；柱温30 ℃；黄柏碱、芦丁、黄芩苷、黄芩素、槲皮素的检测波长205 nm，盐酸小檗碱、苍术素的检测波长为340 nm；体积流量1.0 mL/min；进样量10 μL。

取黄柏碱、芦丁、黄芩苷、盐酸小檗碱、槲皮素、黄芩素、苍术素各对照品适量，精密称定，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶液配制成含黄芩苷0.842 mg/mL、黄柏碱0.168 mg/mL、盐酸小檗碱0.266 mg/mL、黄芩素0.228 mg/mL、芦丁0.160 mg/mL、苍术素0.024 mg/mL、槲皮素0.144 mg/mL的混合对照品溶液。

取龙砂颗粒（批号130901）1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇溶液20 mL，称定质量，超声（功率250 W，频率40 kHz）处理20 min，取出，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得供试品溶液。

按龙砂颗粒的处方和制备工艺制得不加黄芩、黄柏、黄连、苍术的阴性对照品样品，按“2.2.2”项下方法制备得阴性供试品溶液。

精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果样品中黄柏碱、芦丁、黄芩苷、盐酸小檗碱、槲皮素、黄芩素、苍术素色谱峰的保留时间与对照品一致，7种成分分离度良好，并且阴性供试品对预测成分测定无干扰，色谱图见图 1。

1-盐酸小檗碱 2-苍术素 3-黄柏碱 4-芦丁 5-黄芩苷 6-槲皮素 7-黄芩素 1-berberine hydrochloride 2-atractylodin 3-phellodendrine 4-rutin 5-baicalin 6-quercetin 7-baicalein 图 1 混合对照品 (A)、供试品 (B)、阴性供试品 (C) 在340 nm (Ⅰ) 和205 nm (Ⅱ) 处HPLC图Fig.1 HPLC of mixed reference substances (A),samples (B),and negative samples (C) at 340 nm (Ⅰ) and 205 nm (Ⅱ)

取上述混合对照品储备溶液，分别加甲醇稀释成不同质量浓度的对照品溶液，得黄柏碱的质量浓度分别为0.168、0.084、0.042、0.021、0.011 mg/mL，芦丁的质量浓度分别为0.160、0.080、0.040、0.020、0.010 mg/mL，黄芩苷的质量浓度为0.842、0.421、0.211、0.105、0.053 mg/mL，槲皮素的质量浓度为0.144、0.072、0.036、0.018、0.009 mg/mL，黄芩素的质量浓度分别为0.228、0.114、0.057、0.028、0.014 mg/mL，盐酸小檗碱的质量浓度分别为0.266、0.133、0.066、0.033、0.016 mg/mL，苍术素的质量浓度分别为0.024、0.012、0.006、0.003、0.002 mg/mL。精密吸取各混合对照品溶液10 μL，按“2.1”项下方法测定，以峰面积为纵坐标（Y），对照品的质量浓度为横坐标（X）绘制回归曲线，进行线性回归，得到回归方程和相关系数（r）；吸收信号为噪音信号10倍时的进样量确定为定量限，吸收信号为噪音信号3倍时的进样量确定为检测限，结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 7种成分的线性回归方程 Table 1 Linear regression equations of seven constituents 成分 回归方程 r 线性范围/(mg∙mL-1) 检测限/(ng∙mL-1) 定量限/(ng∙mL-1) 黄柏碱 Y＝5.2×107 X＋1.8×106 0.999 9 0.011～0.168 0.683 2.239 芦丁 Y＝3.3×107 X＋7.8×105 0.999 9 0.010～0.160 0.436 1.635 黄芩苷 Y＝2.5×107 X＋3.3×106 0.999 9 0.053～0.842 0.012 0.054 盐酸小檗碱 Y＝2.0×107 X＋6.4×105 0.999 8 0.016～0.266 0.233 0.842 槲皮素 Y＝5.4×107 X＋1.4×106 0.999 9 0.009～0.144 0.145 0.615 黄芩素 Y＝5.1×107 X＋1.3×106 0.999 8 0.014～0.228 0.369 1.211 苍术素 Y＝1.1×108 X＋3.5×105 0.999 7 0.002～0.024 0.562 1.942

表 1 7种成分的线性回归方程 Table 1 Linear regression equations of seven constituentse

精密吸取同一混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，按“2.1”项下色谱条件下进行测定，计算黄柏碱、芦丁、黄芩苷、槲皮素、黄芩素、盐酸小檗碱、苍术素峰面积的RSD分别为0.63%、0.58%、0.40%、0.52%、0.63%、1.01%、0.60%，表明仪器精密度良好。

取同一供试品溶液（批号130901），分别于配制后0、1、2、4、8、12、24、36、48 h，按“2.1”项下方法测定。黄柏碱、芦丁、黄芩苷、槲皮素、黄芩素、盐酸小檗碱、苍术素峰面积的RSD分别为0.56%、0.45%、0.76%、0.44%、1.47%、0.50%、0.65%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

取龙砂颗粒（批号130901），按“2.2.2”项下方法制备样品溶液6份，按“2.1”项下方法测定，计算黄柏碱、芦丁、黄芩苷、槲皮素、黄芩素、盐酸小檗碱、苍术素质量分数的RSD分别为1.69%、2.28%、1.37%、3.42%、2.29%、1.46%、1.54%，表明重复性良好。

取已测定的龙砂颗粒样品（批号130901）9份，每份约0.5 g，精密称定，按对照品加入量为样品中质量分数的80%、100%、120%分别精密加入黄柏碱5.83 mg/mL、芦丁4.22 mg/mL、黄芩苷29.05 mg/mL、槲皮素4.34 mg/mL、黄芩素7.156 mg/mL、盐酸小檗碱8.35 mg/mL、苍术素0.288 mg/mL对照品适量，按照“2.2.2”项下方法制备成供试品溶液，以“2.1”项下方法测定，结果黄柏碱、芦丁、黄芩苷、盐酸小檗碱、槲皮素、黄芩素、苍术素的平均回收率分别为99.83%、100.09%、99.98%、100.14%、99.67%、99.54%、100.06%，RSD分别为1.9%、2.6%、3.7%、2.4%、1.8%、2.1%、3.2%。

取6批龙砂颗粒样品（批号130901、130902、130903、131201、131202、131203），每个样品平行2份，按“2.2.2”项下方法制备供试品，按“2.1”项下色谱条件分别进行测定，根据标准曲线回归方程计算得出各个批次龙砂颗粒中的黄柏碱、芦丁、黄芩苷、槲皮素、黄芩素、盐酸小檗碱、苍术素7种成分的量，结果见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 6批样品中7种成分的定量测定 (n = 2) Table 2 Determination of seven constituents in six batches of samples (n = 2) 批号 质量分数/(mg∙g-1) 黄柏碱 芦丁 黄芩苷 槲皮素 黄芩素 盐酸小檗碱 苍术素 130901 1.508 1.091 7.299 1.116 1.777 2.162 0.069 130902 1.412 1.043 6.941 1.147 1.779 2.105 0.074 130903 1.435 1.051 7.546 0.982 1.792 2.002 0.075 131201 1.389 0.967 6.937 1.017 1.672 2.025 0.064 131202 1.446 1.013 7.118 1.025 1.658 1.911 0.071 131203 1.491 0.915 7.112 0.996 1.703 2.057 0.068

表 2 6批样品中7种成分的定量测定 (n = 2) Table 2 Determination of seven constituents in six batches of samples (n = 2)

本实验考察了超声提取法的溶剂、超声时间、超声温度等因素对样品提取的影响，结果表明超声提取的温度与时间对样品成分的提取影响不大。水提液中强极性组分较多，不适宜用反相色谱柱进行分离检测，而甲醇提取的样品成分色谱峰信息大，各个成分能很好地分离，故采用甲醇超声提取法处理样品。

本实验考察了甲醇-水、乙腈-水系统，结果发现乙腈-水系统干扰较小且分离效果较好，分析时间短，且梯度洗脱过程中基线平稳，因此选择乙腈-水系统。为了改善峰形，把流动相调整为弱酸性，提高分离度。本实验考察了在水相中添加0.02%、0.05%、0.1%的磷酸溶液，结果发现0.02%的磷酸溶液可以达到改善峰形、提高分离度的效果，且较低浓度的酸溶液有利于保护色谱柱，因此选用0.02%磷酸溶液。此外，对柱温、体积流量、进样量等色谱参数进行优化最终确定色谱条件。

通过PDA检测器对龙砂颗粒色谱图进行紫外全波长（190～700 nm）扫描，结果发现检测波长为205 nm处黄柏碱、芦丁、黄芩苷、盐酸小檗碱、黄芩素、槲皮素、苍术素7种成分均有吸收。黄柏碱、芦丁、槲皮素均是在205 nm处是最大吸收，但苍术素吸收有干扰。在340 nm盐酸小檗碱与苍术素是最大吸收，但其他成分吸收小，且黄柏碱无吸收。黄芩苷、黄芩素在275 nm处有最大吸收，其次在205 nm处较340 nm吸收更好。因此，选择205 nm为黄柏碱、芦丁、黄芩苷、黄芩素、槲皮素的检测波长，340 nm为盐酸小檗碱与苍术素的检测波长。

本处方中，苍术、黄柏同用，取二妙散之意，二药合用共奏健脾燥湿、清热之功。根据中医药理论，再结合黄芩、黄连、砂仁、地龙等7味中药，经临床验证对糖尿病合并高尿酸血症疗效确切。对于龙砂颗粒质量标准的建立，因芦丁和槲皮素是常见的黄酮类成分，通过对芦丁和槲皮素的定量测定可以较好地控制制剂质量的稳定性；而黄柏碱、黄芩苷、黄芩素、盐酸小檗碱、苍术素均为方中黄柏、黄芩、黄连、苍术素的代表性活性成分，为本方治疗糖尿病及并发症的主要活性成分，且均可采用HPLC法测定，因此选择上述7种成分作为龙砂颗粒质量控制中定量测定的指标成分。

本实验建立了全时段双波长RP-HPLC同时测定龙砂颗粒中黄柏碱、芦丁、黄芩苷、盐酸小檗碱、黄芩素、槲皮素、苍术素7种成分定量测定的方法。经实验验证，该方法操作简便，准确，重复性好，可以用于控制龙砂颗粒的质量。