簕欓花椒Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC. 为芸香科花椒属植物，主要分布于北纬约25°以南地区，生长于低海拔平地、坡地或谷地。我国分布在海南、福建、广东、台湾、广西、云南等南方地区；国外分布于菲律宾、越南北部等地^[1]。在海南三亚，簕欓花椒野生资源分布丰富。文献报道芸香科花椒属植物中主要含有挥发油、黄酮、生物碱、香豆素、酰胺等成分，临床上用花椒乙醚提取物或花椒挥发油进行消炎止痛^[2]；花椒属植物对4种深部真菌和11种皮肤癣菌均有一定的抑菌和杀菌作用^[3]；另外发现花椒挥发油可抑制H₂₂肝癌细胞增殖并诱导细胞凋亡^[4]。国内外仅见有对海南簕欓花椒中生物碱类化学成分的研究报道^[5]，为探索簕欓花椒中具有药效活性的物质基础，为合理开发利用这一植物资源提供依据，本实验对簕欓花椒进行化学成分研究，并对部分单体化合物进行抗真菌和细胞毒活性测定。从簕欓花椒75%乙醇冷浸提取部位中分离得到了9个化合物，分别鉴定为二氢山柰素（dihydrokaempferide，1）、滨蒿内酯（scoparone，2）、3-吲哚甲酸（1H-indole-3-carboxylic acid，3）、6-oxo- 2(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-3,7-ioxabicyclo-[3.3.0]-octane（4）、辛二酸（suberic acid，5）、4,4-二甲基-1,7-庚二酸（4,4-dinethyl-1,7-heptanedioic acid，6）、丁香酸甲酯（methyl syringate，7）、β-谷甾醇（β-sitosterol，8）、前茵芋碱（preskimmianine，9）。以上化合物除前茵芋碱外，其他化合物均为首次从该植物中分离得到。生物活性测定结果表明，化合物2具有较强的抗真菌活性，化合物1～3具有一定的细胞毒活性。

WRS-1B型数字熔点测定仪（上海精密科学仪器有限公司）；Bruker DPX-400核磁共振仪、Bruker Avance 300核磁共振仪（德国Bruker公司）；Q-TOF Micro质谱仪（美国Maters公司，HR-ESI-MS）；真空薄膜浓缩装置^[6]；旋转蒸发仪（上海亚荣生物技术有限公司）；SHZ-D（3）型循环式真空泵。柱色谱填料为Diaion HP-20、Toyopearl HW-40，MCI-gel CHP-20（日本三菱公司产品）、Sephadex LH-20凝胶Pharmacia Bioteck产品）；RP₁₈（日本YMC公司生产）；柱色谱用硅胶（160～200、200～300目）、薄层色谱用硅胶G和GF₂₅₄均系青岛海洋化工厂产品。

簕欓花椒于2011年9月采自海南三亚，经海南大学药用植物学教授黄世满鉴定为芸香科花椒属植物簕欓花椒Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.。标本（20121031265）存于本实验室，烘干后粉碎成粗粉，过40目筛，备用。

玉米大斑病菌Exserohilum turcicum（E. t）、大麦赤霉病菌Fusarium graminearum（F. g）、小麦赤霉病菌Gibberella saubinetti（G. s）、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea（B. c）、尖孢镰刀病菌Fusarium oxysporum（F. o）、水稻纹枯病菌Rhizoctonia Solani（R. s）、核盘病菌Sclerotinia sclerotiorum（S. s）7个真菌菌株由浙江农林大学微生物实验室提供。丰年虾卵（购自青岛海大百川生物工程有限公司），人工海水孵化2 d得丰年虾Artemia cysts幼虫。DMSO为分析纯。

取干燥的簕欓花椒粗粉6 kg，用75%乙醇冷浸提取5次，合并提取液。提取液采用真空薄膜浓缩装置进行减压浓缩，得到总浸膏400 g。将浸膏超声分散于水中，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇依次萃取。将所得各萃取部位用真空薄膜浓缩装置进行减压浓缩，得到石油醚部位（30 g）、醋酸乙酯部位（80 g）、正丁醇部位（160 g）和水部位（100 g）。将所得醋酸乙酯部位（80 g）通过硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇溶剂系统梯度洗脱，得到6个洗脱部位。每个部位再通过MCI-gel CHP-20、Toyopearl HW-40和Sephadex LH-20柱色谱，用甲醇-水系统反复洗脱，得到化合物1（85 mg）、2（60 mg）、3（10mg）、4（45 mg）。正丁醇部位（80 g）分散于水中，通过大孔吸附树脂Diaion HP-20柱色谱，依次用水及10%、20%、40%、60%、100%甲醇洗脱。其中Diaion HP-20柱色谱的40%甲醇洗脱部分通过MCI-gel CHP-20柱色谱，以甲醇-水溶剂系统反复分离纯化，从中分离得到化合物6（42mg）、7（12 mg）。Diaion HP-20柱色谱的60%甲醇部位通过硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇溶剂系统反复洗脱，得到化合物5（90 mg）、8（360 mg）、9（12 mg）。

将配好的PDA（马铃薯300 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20 g、蒸馏水1 000 mL）湿法灭菌后，在超净台上将凝固的PDA加热融化，趁热将700 μL的PDA导入2 mL的离心管中，倾斜放置，制作成斜面，冷却，凝固后形成斜面培养基，备用。采用二倍稀释法^[8]将单体化合物以DMSO为溶剂配制成不同浓度梯度。

将配好的样品用移液枪移入试管中的PDA表面上，每次加样量为40 μL，并立刻摇匀，使其均匀接触PDA表面。阴性对照组只在PDA表面加DMSO，空白组在PDA表面不加样品。

采用斜面试管法测定抗菌活性，根据最低抑菌浓度（MIC）判断抑菌能力。将化合物1～3分别用95%乙醇稀释至250.00、125.00、62.50、31.25、15.63 μg/mL的5个不同的质量浓度梯度。将7种植物病原真菌在培养皿中培养后，用打孔器打孔，再将打好孔的真菌分别放入上述配好样品溶液的试管中，在培养箱中培养48 h后，观察长菌情况，以不长菌的样品最低溶液质量浓度作为MIC值，平行3次，实验结果取平均值。

取适量丰年虾的虾卵，放入浓度为2.5%的人工海水中，28 ℃下避光培养48 h，备用。样品用（1% DMSO增溶）人工海水配制成2 mg/mL的溶液，分别取10、8、6、4、2、1、0.5 μL于96孔板中后，用含有15～20只虾虫的海水溶液补足至200 μL，人工海水为空白对照，每一样品重复3次，28 ℃下避光培养24 h，放大镜下观测海虾死亡数，根据公式计算校正死亡率，采用SPSS软件的Prohibit模型计算半数致死浓度（LC₅₀）。

校正死亡率＝(T－C)/(1－C)

T为样品致死率，C为空白对照致死率

化合物1：淡黄色粉末，mp 206～207 ℃。HR-MS m/z: 303.065 6 [M＋H]⁺。¹H-NMR (400 MHz, C₅H₅N) δ: 7.51 (1H, s, H-8), 7.01 (2H, d, J = 8.5 Hz H-2′, 6′), 6.45 (2H, d, J =8.5 Hz H-3′, 5′), 5.50 (1H, d, J = 9.0 Hz, H-2), 3.82 (3H, s, -OCH₃), 3.21(1H, d, J = 12.9 Hz, H-3)；¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 197.6 (C-4), 168.4 (C-7), 165.7 (C-5), 164.7 (C-9), 158.7 (C-4′), 147.3 (C-1′), 133.1 (C-2′, 6′), 114.5 (C-3′, 5′), 112.5 (C-10), 103.4 (C-6), 97.1 (C-8), 96.2 (C-2), 80.3 (C-3), 56.4 (4′-OCH₃)。以上数据与文献报道数据一致^[11]，故鉴定化合物1为二氢山柰素。

化合物2：无色针晶（甲醇）。HR-MS m/z: 206.048 3 [M－23]⁻。¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.63(1H, d, J = 9.2 Hz, H-4), 6.86 (1H, s, H-5), 6.85 (1H, s, H-8), 6.29 (1H, d, J = 9.6 Hz, H-3), 3.96 (3H, s, 6-OCH₃), 3.93 (3H, s, 7-OCH₃)；¹³C-NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 161.4 (C-2), 152.8 (C-6), 150.0 (C-7), 146.3 (C-9), 143.4 (C-4), 113.6 (C-3), 111.4 (C-10), 107.9 (C-8), 100.0 (C-5), 56.4 (6-OCH₃), 56.4 (7-OCH₃)。以上数据与文献报道数据一致^[12]，故鉴定化合物2为滨蒿内酯。

化合物3：黄色粉末，mp 210～215 ℃，HR-MS m/z: 161.037 3 [M－Na]⁻，分子式为C₉H₇O₂N。¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 8.09 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-7), 7.90 (1H, s, H-2), 7.42 (1H, t, J = 8.8 Hz, H-4), 7.17 (1H, d, J = 6.8 Hz, H-6), 7.14 (1H, t, J = 6.8 Hz, H-5)；¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD) δ: 169.3 (-COOH), 138.2 (C-8), 133.0 (C-2), 127.7 (C-9), 123.6 (C-5), 122.1 (C-6), 122.1 (C-4), 112.8 (C-7), 108.7 (C-3)。以上数据与文献报道的数据一致^[13]，故鉴定化合物3为3-吲哚甲酸。

化合物4：无色针晶（甲醇），mp 197～198 ℃，TCL薄层板上喷FeCL₃-K₃[Fe(CN)₆] 显蓝色。HR-MS m/z: 280.084 0 [M－23]⁻，分子式为C₁₄H₁₆O₆。¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.25 (1H, s, 4-OH), 6.62 (2H, s, H-6), 4.61 (1H, m, H-7), 4.41 (2H, m, H-9), 4.08 (2H, m, H-9′), 3.78 (6H, s, -OCH₃), 3.55 (1H, m, H-8′), 3.11 (1H, m, H-8)。以上数据与文献报道一致^[14]，故鉴定化合物4为6-oxo-2(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-3,7-dioxa- bicyclo-[3.3.0]-octane。

化合物5：白色鳞片状固体，有臭味，mp 145 ℃，与1%的香草醛-浓硫酸反应呈淡蓝色，与溴酚蓝试剂反应显黄色。¹H-NMR (400 MHz, C₅H₅N) δ: 14.70 (1H, brs, -COOH), 2.47 (2H, d, J = 7.2 Hz, H-2, 7), 1.71 (2H, m, H-3, 6), 1.26 (2H, m, H-4, 5)；¹³C-NMR (100 MHz, C₅H₅N) δ: 175.1 (C-1, 8), 34.6 (C-2, 7), 29.3 (C-3, 6), 25.0 (C-4, 5)。以上数据与文献报道基本一致^[15]，故鉴定化合物5为辛二酸。

化合物6：白色粉末，HR-MS m/z: 188.097 5 [M＋H]⁺，分子式为C₉H₁₆O₄；mp 105～107 ℃。¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 2.5 (4H, t, J = 7.3 Hz, H-2, 6), 2.18 (4H, t, J = 7.3 Hz, H-3, 5), 1.30 (6H, s, 2×CH₃)；¹³C-NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 174.1 (C-1, 7), 33.9 (C-2, 6), 28.4 (C-3, 4, 5), 24.2 (C-8, 9)。以上数据与文献报道基本一致^[16]，故鉴定化合物6为4,4-二甲基-1,7-庚二酸。

化合物7：白色无定形粉末，mp 125～126 ℃，分子式为C₁₀H₁₂O₅。¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.30 (1H, s, H-2, 6), 3.86 (1H, s, H-7, 8), 3.87 (3H, s, H-9)；¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 168.6 (C-10), 148.9 (C-3, 5), 142.0 (C-4), 121.4 (C-1), 108.1 (C-2, 6), 56.8 (C-7, 8), 52.5 (C-9)。以上数据与文献报道一致^[17]，故鉴定化合物7为丁香酸甲酯。

化合物8：白色粉末（丙酮），TLC上10%硫酸-乙醇溶液加热显紫红色，与β-谷甾醇对照品用3种不同展开剂共薄层，二者Rf值均相同，故鉴定化合物8为β-谷甾醇。

化合物9：黄色颗粒状晶体（甲醇），紫外光下呈蓝紫色荧光，碘化铋钾反应阳性，与前茵芋碱对照品进行薄层对照，在3种不同展开条件下展开Rf值均相同，故鉴定化合物9为前茵芋碱^[18]。

以斜面试管法测定样品的抗菌活性。化合物1～3对7种植物病原真菌的MIC见表 1。由实验结果可以看出，化合物2的抑菌活性最好，特别是对玉米大斑病菌、大麦赤霉病菌，其MIC均为15.63 μg/mL。

表 1(Table 1)

表 1 化合物1～3对7种植物病原菌的MIC Table 1 MIC values of compounds 1—3 on seven kinds of plant pathogenic bacteria 化合物 MIC/(μg∙mL−1) E. t G. s F. g B. c R. s F. o S. s 1 — — 15.63 — 125.00 250.00 125.00 2 15.63 250.00 15.63 — 250.00 250.00 — 3 — — 125.00 — 125.00 250.00 —

表 1 化合物1～3对7种植物病原菌的MIC Table 1 MIC values of compounds 1—3 on seven kinds of plant pathogenic bacteria

近年来，国内常用体外法和体内法对抗肿瘤药物进行初步筛选，2种方法都需要用动物的移植肿瘤作为病理模型，或以人或动物肿瘤细胞培养作为筛选系统，并且在实验中需无菌操作，要求严格，观察周期长，成本较高，对大量的抗肿瘤药物初步筛选带来许多不便。海虾幼虫致死性生物测定法的优势在于海虾幼虫卵在干燥状态下可存活时间长，需要用的时候在室温下将其置于海水里，就可孵化成许多幼虫。这样药物筛选供试动物材料来源简捷，既无需动物血清，也无需无菌操作，用药量少且成本极低，便于大批量生物学统计，是一种快捷经济的抗肿瘤药物初步筛选的新方法^[19]。

按照海虾致死的生物活性法测定化合物的半数致死浓度，据文献报道^[20]，粗提物的LC₅₀＜1 000 μg/mL和单体化合物的LC₅₀＜100 μg/mL时，表明实验样品具有明显的细胞毒活性。实验得出，化合物1～3对海虾致死的LC₅₀分别为9.8、2.6、4.9 μg/mL，表明其均具有一定的细胞毒活性。