三七Notoginseng Radix为五加科（Araliaceae）人参属Panax L. 植物三七Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen的干燥根，主产于我国云南、广西及四川等地^{[1, 2]}。三七中含有皂苷、糖类、氨基酸、黄酮、油脂、微量元素等活性成分，具有散瘀止血、消肿止痛的功效^[2]。其中，三七总皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）是三七的主要活性成分，其量高达12%^[3]。研究表明，PNS和部分单体皂苷在心脑血管系统、神经系统、物质代谢以及抗炎、抗肿瘤等方面均有较好的生理活性，且对某些疾病的药用价值远高于人参Panax ginseng C. A. Mey.^{[2, 3, 4, 5]}。

随着PNS和部分单体皂苷生物活性研究的深入，市场需求也越来越大。但是，三七对生长环境要求苛刻，适宜栽种地域狭小，传统栽培方法的产量难以满足市场需求，导致三七市场价格不断上升，并出现假三七扰乱市场的问题，不利于中药市场的繁荣。近年来，药用植物次生代谢产物合成的基因调控已成为分子生物学十分活跃的前沿研究领域而皂苷类物质是植物次生代谢产物的重要组成部分，其量和组成主要取决于生物合成关键酶以及在细胞中的表达水平。随着三萜皂苷生物合成过程中相关酶系研究的不断深入，通过代谢工程手段调控三七皂苷的生物合成逐步成为可能^[6]。

PNS的主要成分为人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rg₁、三七皂苷R₁等达玛烷型四环三萜皂苷。目前，对植物达玛烷型四环三萜皂苷的生物合成途径已有初步的认识，一般可划分为3个阶段：（1）异戊烯基焦磷酸（isopentenylallyl diphosphate，IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMPP）的合成；（2）IPP和DMPP被异戊烯基转移酶和萜类环化酶催化合成2,3-氧化鲨烯（2,3-oxidosaqualene）；（3）2,3-氧化鲨烯依次经过环化、羟基化、糖基化修饰，最终形成PNS^[6]。

PNS生物合成途径包含了209步连续的酶促反应，其可能的关键酶有3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMGR）、法呢基焦磷酸合成酶（farnesyl pyrophaophate synthase，FPS）、鲨烯合成酶（squalene synthase，SS）、鲨烯氧化酶（squalene epoxidase，SE）、达玛烯二醇合成酶（dammarenediol synthase，DS）、P450单加氧酶（cytochrome P450 monooxygenases，CYP450）和糖基转移酶（glycosyltransferase，GT）。另外，催化2,3-氧化鲨烯转变为植物甾醇的关键酶——环阿屯醇合成酶（cycloartenol synthase，CAS）的活性也间接影响PNS的合成，因为植物甾醇与达玛烷型三萜皂苷共享前体物质2,3-氧化鲨烯^[7]。图 1中所示的生物合成途径从鲨烯开始专属于PNS和植物甾醇的合成途径，开展鲨烯合酶及其后续代谢途径关键酶的基因克隆和调控研究，对PNS的合成及其相关基因功能的研究有直接而重要的意义^[8]。因此，本文主要针对FPS、SS、SE、DS、CAS等与PNS碳骨架形成和修饰过程直接相关的酶进行介绍。

图中虚线表示多步酶促反应；ACAT-乙酰辅酶A酰基转移酶 DXPS-1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 HMGS-3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶 DXR-1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 HMGR-HMG-CoA还原酶 CMS-4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶 GPPS-牻牛儿基焦磷酸合酶 CYP450-P450单加氧酶 Dotted lines indicate several enzyme reactions; ACAT-acetyl-CoA acyltransferase DXPS-1-deoxy-D-xyulose-5-phosphate synthase HMGS- 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase DXR-1-deoxy-D-xyulose-5-phosphate reductoisomerase HMGR-3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reducetase CMS-4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol synthase GPPS-geranylpyrophosphate synthase CYP450-P450 monooxygenase 图 1 PNS的生物合成途径Fig.1 Biosynthesis pathway of PNS

FPS是一种异戊烯基转移酶，是类异戊二烯途径的1个关键酶。它催化5碳原子的IPP和DMPP以1～4头尾连续缩合反应，形成15碳的法呢基焦磷酸（farnesyl diphosphate，FPP）。FPP是植物体内许多萜类物质合成的前体，是1个同型亚基二聚体。典型的FPS有2个富含天冬氨酸的模序，每个亚基均有底物丙烯基焦磷酸（allyl pyrophosphate，APP）及IPP结合位点。FPS是基因家族编码的产物，在植物中可提供对环境变化或抗食草动物、病原体袭击的差异调节。Lan等^[9]报道了姜花1个新的FPS全长cDNA序列1 068 bp，开放阅读框编码356个氨基酸，相对分子质量为4.07×10⁴的蛋白质。对姜花Hedychium coronarium Koen. 中HcFPS mRNA和相应的挥发性倍半萜量进行组织特异性和发育分析发现，HcFPS可能调节花的挥发性倍半萜的合成。FPS衍生的挥发性萜类的释放与植物叶的机械损伤和姜弄蝶损伤所诱导的FPS强表达有关，这表明HcFPS在姜花营养器官中有重要的功能。

对FPS基因在植物中的表达模式的研究中发现，该基因具有组织表达特异性，而且也伴随着类异戊二烯衍生物量的增加。Cunjllera等^[10]克隆了拟南芥Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh. FPS cDNA，分析表明拟南芥FPS1和FPS2基因在幼苗、根、茎、叶和花中都表达。其中，FPS1 mRNA在根和花序中表达水平最高，而FPS2 mRNA则以较低水平表达，但优先在花序中累积。目前已从三七、罗汉果Siraitia grosvenorii (Swingle) C. Jeffrey ex Lu et Z. Y. Zhang、积雪草Centella asiatica (Linn.) Urban、青蒿Artemisia carvifolia Buch. -Ham. ex Roxb. 等40多种植物中分离并克隆了FPS的cDNA序列。

周秘等^[11]利用RT-PCR技术，对刺五加Acanthopanax senticosus (Rupr. et Maxim.) Harms FPS基因在不同产地、不同器官、不同发育时期及茉莉酸甲酯（MeJA）处理后的表达情况进行了分析。结果表明，FPS在不同产地、时期、器官及MeJA处理后的刺五加中均有表达，但表达水平存在显著差异，且FPS的相对表达量与刺五加叶器官的皂苷量存在显著的正相关关系。Guo等^[12]报道了1个潜在药用植物虎眼万年青Ornithogalum caudate Jacq.的FPS全长cDNA序列，在大肠杆菌Escherichia coli中成功表达可溶性的OsaFPS，经SDS-PAGE得到验证。近年来，进行了大量的有关FPS基因过表达的研究。Kim等^[13]为了明确FPS在三萜皂苷生物合成中的功能，构建了调节FPS表达的基因并转化入人参毛状根中。相对于野生对照株，转基因株表现出更高的PgFPS表达水平，转化株F11和F20的PgFPS转录水平比对照株高11.1倍。转化株F17人参总皂苷量最高（36.42 mg/g），比对照株高2.4倍。人参代谢工程已成功实现经毛根农杆菌Agrobacterium tumefaciems介导的转化，通过将PgFPS基因导入人参的毛状根中，使植物甾醇和人参皂苷的积累量明显增加，说明PgFPS在人参的三萜生物合成中起重要作用。

吴耀生^[14]采用同源分析设计引物进行RT-PCR扩增，得到三七FPS的cDNA全长为1 409 bp，GenBank登录号为DQ059550。根据三七FPS cDNA推测的蛋白质读码框架为130～1 161 bp，编码343个氨基酸。比对分析及构建的系统进化树表明，三七与人参、积雪草的FPS序列一致性分别为99%和95%，其三萜物质结构也相似。同时，还构建了三七FPS的原核表达载体pET32a (+)-FPS，并成功转化到大肠杆菌BL21（DE3）中。蛋白电泳分析表明，转化的阳性菌能在适当的条件下表达重组蛋白。pET32a (+)-FPS受到异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导时，表达的重组蛋白随着IPTG浓度的增大而增加。其相对分子质量为4×10⁴左右，与预期相符。陈莉等^[15]用RACE技术从三七中克隆出FPS基因，蒋东等^[16]参照罗汉果FPS基因，扩增了绞股蓝Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino FPS基因的3’RACE引物，并采用3’RACE和5’RACE法克隆了绞股蓝FPS基因全长cDNA。

SS是一种结合在内质网上的膜结合酶，它催化2分子FPP结合形成鲨烯，由鲨烯继续生成三萜化合物和植物甾醇。SS在催化2分子FPP形成鲨烯的过程中需要还原型辅酶II（NADPH）作为氢供体，同时具有2价金属离子依赖性。Liu等^[17]研究显示，人源SS及其突变体和几种底物类似物与Mg²⁺或Mn²⁺的中间体结合形成复合物。在SS活性位点存在于还原型NADPH结合的关键性残基。基于突变数据和在hSS-(F288L)-PSPP复合物中观察到的局部封闭结构（JK环路），提出了SS的NADPH结合模型，确定了4个参与1′-1′类异戊二烯生物合成途径有序连续机制的主要步骤：底物结合、缩合、中间形成和转运。Ye等^[18]得到盾叶薯蓣Dioscorea zingiberensis C. H. Wright SS基因全长cDNA序列，并成功将羧基端去除24个氨基酸的DzSS在大肠杆菌中表达，然后将细菌粗提物和FPP及NADPH共体系反应，用GC-MS在此体外反应混合物中检测到鲨烯。同时用RT-PCR分析表明，DzSS在不同器官和不同时期的表达有显著性差异，这可能与SS的功能有关。

目前认为SS是三萜类化合物和植物甾醇生物合成的关键酶。编码SS的基因已从多种植物中克隆和鉴定，包括三七、人参、甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、金铁锁Psammosilene tunicoides W. C. Wu et C. Y. Wu、绿玉树Euphorbia tirucalli Linn.等。随着近年来更多植物的SS基因被克隆，发现许多植物存在SS的多态性。马艺沔等^[19]通过RT-PCR法得到2个丹参 Salvia miltiorrhiza Bunge SS基因，它们编码的多肽具有鲨烯合酶相关结构域和保守基序。这2个基因具有不同的外显子/内含子结构特征，以及不同的组织特异性表达模式和时间表达模式，可能在丹参甾体类和三萜类化合物生物合成中起不同作用。邢朝斌等^[20]以actin为内参基因，利用RT-PCR技术，分析刺五加不同发育时期、不同器官及NeJA处理对SS1、SS2基因表达及皂苷量的影响，结果表明刺五加SS基因家族SS1、SS2在整个生长期和各器官中均有表达，且表达量差异显著（P＜0.05）。刺五加SS1的表达量与皂苷量间的相关性小，SS2的表达量与皂苷量呈显著的正相关关系（P＜0.01）。SS2是刺五加中三萜皂苷生物合成中的关键酶，其表达量的高低决定了皂苷量的高低。刘颖等^{[21, 22]}分析了4个存在明显差异的SS序列的单核苷酸多态性（SNPs）、插入与缺失多态性（InDel）和选择性剪接多态性（AS），并通过体外酶促反应研究其编码酶催化效率。同时根据甘草鲨烯合酶1基因多态性及其与β-香树脂醇合成酶共表达对β-香树脂醇积累的影响，提出甘草SS基因丰富的多态性，其编码酶催化效率差异显著，可能是优质甘草形成的分子基础。

吴耀生等^[23]利用RT-PCR技术成功从三七中获得SS cDNA，全长1 270 bp，编码415个氨基酸。GenBank登录号为DQ18663。同源性分析发现，三七SS氨基酸序列与人参、青蒿、拟南芥和水稻Oryza sativa Desv. 的SS氨基酸序列一致性分别为98%、81%、78%和71%。

石磊^[24]通过农杆菌介导法将构建好的pCAMBIA2300S-SS植物表达载体转入三七子叶愈伤细胞，利用基因组PCR法初步检测含卡那霉素抗性转基因的三七细胞，然后通过荧光定量PCR对基因组PCR阳性细胞进行转录水平的表达分析，最后以阳性细胞为材料，检测PNS和单体皂苷的量。分析三七转基因细胞株中转录水平、单体皂苷和PNS量可知，转基因细胞株中SS转录水平均有所增加，单体皂苷、PNS的量大部分有所提高，初步表明SS转录水平的提高有利于皂苷量的积累，说明SS在三七皂苷生物合成中起着重要的调控作用。SS在三七中超表达能够明显提高三萜类物质的量。孙颖等^[25]成功构建了SS植物超表达载体，利用农杆菌介导法将超表达载体转移并整合到三七愈伤组织中，实现SS基因的超表达，初步表明SS转录水平的提高有利于皂苷量的积累，明确了SS基因在三七皂苷生物合成途径中的调节功能。

SS既是三萜和甾醇分支代谢流中的第1个酶，也是第1个关键酶，对植物甾醇和三萜生物合成均起着重要调控作用。

SE是一种单加氧酶，催化鲨烯合成2,3-氧化鲨烯，是三萜皂苷和植物甾醇生物合成途径中的关键酶之一。鲨烯在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E. C. Hansen中作为第1前体专用于麦角甾醇（provitamin）的生物合成。Garaiová等^[26]报道，不管是用特比萘芬引起编码SE的ERG1基因的定点突变，使SE活性降低，还是使用SE抑制剂均会造成鲨烯的积累。但是前者不会影响酿酒酵母的生长，后者会造成明显的酿酒酵母生长缺陷，证明SE与鲨烯的转化有关。Han等^[27]通过对人参三萜皂苷和甾醇生物合成中的2个SE基因（PgSE1和PgSE2）进行研究，发现二者在不同部位的表达以及受到MeJA诱导下的表达均不相同。PgSE1 RNA干扰（RNAi）完全抑制PgSE1的转录，伴随着人参皂苷的量减少；用RNAi沉默PgSE1可使人参根中PgSE2和CAS明显上调，导致甾醇大量积累。李宝财等^[28]用RT-PCR技术对刺五加SE基因的表达进行了分析，探讨了其与刺五加皂苷量的关系。结果显示不同产地、器官及发育时期的刺五加SE表达量差异显著，且SE的表达与刺五加皂苷的量存在显著的正相关关系（P＜0.05）。

牛云云等^[29]从三七中获得2种类型的SE编码基因PnSE1、PnSE2，PnSE1与PnSE2基因预测编码蛋白分别包含537和545个氨基酸，序列相似性为79%，但N端（前70个氨基酸）序列不保守。对PnSE1、PnSE2进行生物信息学分析，并通过RT-PCR方法检测其在4年生三七不同组织部位的表达模式，以及受MeJA诱导处理后基因的表达量变化，PnSE1基因在根、茎、叶、花中均有表达，以花中表达丰度最高；PnSE2基因只在花中表达量显著，其余组织较弱。MeJA诱导24 h后PnSE1基因在叶中的表达量最大；相同诱导条件下，PnSE2基因未响应诱导，表达水平无显著变化。结果表明，PnSE1和PnSE2基因具有不同的表达模式，在三七次生代谢产物合成中起不同的催化作用，推测PnSE1基因参与三萜皂苷生物合成，PnSE2基因则在甾醇合成途径中起催化作用。该推测与蒺藜苜蓿Medicago truncatula Gaertn、人参中2种SE同源基因表达模式相似。

已经在多个物种中对SE进行了克隆与鉴定。李坤^[30]采用改进的异硫氰酸胍一步法提取三七根总RNA，通过RT-PCR法从三七根组织总RNA中扩增出SE基因的cDNA序列，cDNA序列长1 648 bp，开放阅读框共编码537个氨基酸残基。序列分析表明：三七SE氨基酸序列与人参、毛曼陀罗Datura innoxia Miller、亚洲栽培稻、刺番茄Solanum lycopersicum Swartz、拟南芥和甘蓝型油菜Brassica napus Linn. 的同源性分别为97%、76%、73%、71%、70%和45%；核酸序列的同源性分别为97%、63%、62%、62%、60%和48%；GenBank序列号为DQ457054。并成功构建表达载体pET30a (+)-SE，测序结果显示其读码框架正确。该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）plys感受态细胞并经IPTG诱导首次表达出SE的融合蛋白质——His6-SE（N端带6个His的SE）。SDS-PAGE结果显示，诱导的工程菌能明显表达出相对分子质量约为6.4×10⁴（包括质粒本身表达的约5.0×10³的氨基酸）的蛋白质，与His6-SE的理论相对分子质量基本相符，说明成功地扩增了三七SE基因，表达出三七SE融合蛋白质。和凤美^[31]对三七SE cDNA序列进行的生物信息学分析表明，三七SE是一个膜蛋白，可从胞质溶胶中分泌出来。RT-PCR实验结果证明，三七SE在三七不同组织中存在差异表达，在根中的表达水平高于茎和叶，而茎中又高于叶，3年生根中的表达又高于1年生根中的表达。这些结果说明，三七SE基因的表达可能是组织特异性的。以上研究结果可为阐明三七皂苷生物合成途径和其药理学活性奠定基础。

DS是氧化鲨烯环化酶（squalene-2,3-oxidecy- cloartenolcyclase，OSCs）中的一种，催化2,3-氧化鲨烯环化为达玛烯二醇。PNS属于达玛烷型四环三萜皂苷，而达玛烯二醇是达玛烷型皂苷的前体，所以DS在三萜皂苷合成中起着重要的调节作用。近年来开发了很多DS体外表达生产达玛烯二醇的模型，并且逐渐从原核细胞表达体系发展到真核植物细胞表达体系。

Liang等^[32]成功实现了DS基因在工程酿酒酵母菌中的异源表达，并用硅胶色谱法和HPLC在发酵液中检测到达玛烯二醇。同时还探索了重组酿酒酵母工程菌在不同培养条件（有氧和厌氧）下达玛烯二醇的积累水平。Hu等^[33]通过特异性引物从5年生人参根cDNA噬菌体文库中筛选出DS基因，构建了重组表达载体——重组质粒PET-30A-DS，表达于罗塞塔大肠埃希氏菌。重组的DS蛋白经亲和色谱纯化并通过SDS-PAGE被检测到，而产物中的达玛烯二醇也通过LC-MS被检测到。研究显示，重组的DS蛋白可以提高达玛烯二醇的产量，同时也说明DS的表达在人参皂苷的生物合成中发挥了重要作用。Wang等^[34]克隆了西洋参Panax quinquefolius Linn. 的DS基因PqDS，并实现了在酵母菌中的异源表达，用液相色谱-大气压化学电离质谱（LC/APCI-MS）在菌液中检测到达玛烯二醇。此外，在PqDS过表达的转基因毛状根中，PqDS转录增加的同时也伴随着另一P450基因PqD12H（编码西洋参原人参二醇合酶）的增加。用LC/APCI-MS在PqDS和PqD12H基因共表达的重组酵母培养混合物中检测到原人参二醇（protopanoxadiol），揭示了三萜皂苷生物合成途径中各酶间的相关性，同时也预示着三萜皂苷体外合成的可行性。Han等^[35]建立了通过转基因烟草悬浮细胞培养来生产达玛烯二醇的方法，转基因的PgDS来自于人参并置于农杆菌介导转化的35S启动子控制下。转基因烟草植株中达玛烯二醇的积累存在器官特异性，并导致植物甾醇量的降低。此外，达玛烯二醇可能在植物中充当防御物质，特别是防御烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV），这可能和DS与葡糖醛酸糖苷酶（glucuronidase，GUS）的共表达有关^[36]。

目前已从三七、人参、积雪草、粗茎鳞毛蕨Dryopteris crassirhizoma Naka等植物中克隆得到编码DS的基因。Luo等^[37]以454GS FLX Titaninm高通量测序技术（454 GS FLX Titanium system）对4年生三七根的cDNA文库进行了1/4个run的测序，产生了平均长度为410 bp的188 185个序列。这些序列用454 GS De Novo汇编软件初步分析和收集，产生了30 852个独立基因（unique sequences）。用基本局部对比搜索工具（BLAST）对独特序列与公共序列数据库进行了相似性搜索，总数的70.2%得到注释。京都基因与基因组百科全书（KEGG）任务显示，41个独特序列代表在454-EST数据库中的11个三萜皂苷碳骨架生物合成基因。其中DS基因包含1 018个序列，GenBank登录号为GU997680。对其进行的同源性分析表明，人参、西洋参和三七均编码769个氨基酸并具有高度相似性。在DS蛋白质水平上，三七与人参和西洋参分别表现出98.7%和99%的同一性。石磊^[24]对三七DS进行了序列分析，DS全长cDNA序列长度为2 500 bp，包含一个2 310 bp的开发阅读框；对DS进行的结构域功能分析显示，DS蛋白序列的结构域与氧化鲨烯环化酶的结构域相似，已知的氧化鲨烯环化酶催化2,3-氧化鲨烯环化生成甾醇和三萜类的前体物质，如人参中的角鲨烯经β-香树脂醇合成酶（β-AS）、DS，这与三七中的DS功能相符。

Han等^[38]利用RNAi技术使人参中的DS沉默，导致人参皂苷的量减少了84.5%。最近有研究报道，MeJA可以上调植物中DS的表达，从而提高细胞中三萜皂苷的量^[39]。如用MeJA处理人参毛状根7 d后，毛状根中原人参二醇和原人参三醇（protopanaxatriol）的量分别增加了5.5～9.7和1.85～3.82倍，同时，基因水平检测表明，毛状根中的SS、SE、DS转录水平均显著提高。说明DS在三萜皂苷生物合成途径中扮演重要的角色，是三萜皂苷生物合成的关键调控点。

CAS属于OSCs的一种，催化2,3-氧化鲨烯环化生成环阿屯醇。Basyuni等^[40]将从红海榄Rhizophora stylosa Griff. 和秋茄Kandelia candel (Linn.) Druce中克隆得到的CAS基因转入羊毛甾醇合成酶基因缺陷型酿酒酵母突变菌株GIL77中，突变酿酒酵母细胞中有环阿屯醇积累，说明CAS能催化2,3-氧化鲨烯环化生成环阿屯醇。

CAS蛋白处于皂苷合成的分支处，不同的OSCs蛋白参与不同种类的皂苷合成。若其中一种分支酶出现缺陷，则可能导致2,3-氧化鲨烯的积累及各下游产物比例发生变化^[41]。Dhar等^[42]克隆得到了催眠睡茄Withania somnifera Linn. 3个全长OSCs的cDNA序列，包括β-香树素合成酶（WsOSC/BS）、羽扇豆醇合酶（WsOSC/LS）和CAS（WsOSC/CS），并通过LC-MS和动力学研究证实了各自在粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyce spombe中异源表达的功能；并通过观察3种OSCs在不同诱导下的mRNA和蛋白水平，证明在1条支流的OSC的转录水平发生变化会引起其他支流的相应变化。另外，OSCs参与合成的各类皂苷是生物膜的重要组成成分，且可能承担了重要的生物学功能。有研究表明，植物CAS与植物中叶绿体类囊体膜形成及内质网膜各组分平衡有关，而如果植物中基因发生变异，导致CAS缺陷，则可能使植物出现白化等现象，在缺陷较为严重时可能会致死^[43]。

CAS与DS享有共同前体2,3-氧化鲨烯，从2,3-氧化鲨烯开始，出现了三萜类化合物代谢支流和植物甾醇支流。三萜类化合物代谢支流由DS催化2,3-氧化鲨烯合成达玛烯二醇，成为该支流的第一步反应；植物甾醇支流由CAS催化2,3-氧化鲨烯环化生成环阿屯醇，目前认为CAS是该支流的第1个关键酶^[44]。吴耀生^[14]对三七根CAS基因cDNA进行了克隆测序，获得三七CAS基因，全长2 293 bp。翻译的起始密码位于第9碱基处，终止密码位于第2 285碱基处，开放阅读框架共编码758个氨基酸。三七GenBank登录号为EU342419。比对分析表明，三七根CAS与人参CAS氨基酸序列一致性为90.1%。近年来，有研究认为抑制植物中CAS表达能够提高三萜的积累量。孙颖等^[45]利用Cateway技术建立了CAS基因的RNAi表达载体，并利用农杆菌介导法转移并整合到三七基因组中，由此方法抑制CAS基因的表达，阻断植物甾醇的合成，间接增加三七皂苷的量。何沐阳^[46]利用RNAi技术，通过RT-PCR扩增人参CAS基因的核心保守序列，然后利用重组PCR方法构建含有发夹结构的RNAi植物表达载体。再利用发根农杆菌A4介导，将含CAS核心保守序列的RNAi植物表达载体转入到人参细胞内，最终得到CAS基因表达受到干扰的人参发根系；并对RNAi CAS基因的表达效果以及CAS被干扰后人参发根内三萜物质量的变化进行了研究。结果显示，CAS基因RNAi发根系的环阿屯醇量比对照组降低了80.64%，而达玛烯二醇量有所增加；采用紫外分光光度法分析人参总皂苷的量和总植物甾醇的量，结果显示CAS基因RNAi发根系的植物甾醇量比对照平均降低53.61%，而人参皂苷量有所增加；用高效液相色谱法分析检测人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁的量，结果显示，CAS基因RNAi发根系的人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁量相对于对照组均有不同程度的升高。在拟南芥中通过对CAS等位基因突变体的特性研究发现，CAS等位基因突变使得CAS表达量下降，并引起上游HMRG基因表达升高，从而促使三萜皂苷增加。表明CAS是植物甾醇合成的关键酶，也是调控三萜皂苷合成的重要调控点^[47]。

CYP450是一类超基因家族编码的含有血红素的氧化酶类，分布于各种需氧生物体内，如植物、动物、真菌以及细菌等。在植物体内催化多种初生和次生代谢反应，参与萜类、生物碱类、脂肪酸、甾醇类、植物激素、信号分子、色素及植物抗毒素防御等合成与代谢反应^{[48, 49]}。其催化作用的共同特点是在作用物分子中加入一个氧原子。其中在三萜皂苷的生物合成中，CYP450主要催化三萜骨架惰性甲基和亚甲基的氧化。鉴于植物CYP450催化反应的复杂性，关于其催化机制的研究较少。在植物体内，CYP450在不同组织中的表达具有特异性，如在皂苷合成较多的根和花中的表达量明显高于其他组织。在三萜皂苷合成代谢途径中，SS、FPS和DS等基因会响应MeJA诱导表达量上调，从而使下游CYP450的表达量也随之增加^[50]。结合上述2种CYP450的表达特性不难看出，将植物特定组织进行MeJA诱导，筛选与上游基因SS及DS相似表达模式的CYP450，是从CYP450s家族中筛选参与人参皂苷生物合成的CYP450的重要手段^[51]。吴鹏等^[52]利用RT-PCR分析了刺五加CYP450基因在不同产地、不同器官、不同发育时期及受到MeLA刺激下的表达规律，结果表明CYP450表达量差异极显著（P＜0.01），且CYP450基因表达量与总皂苷量间存在极显著的正相关关系（P＜0.01）。近年来，五加科的三七、人参和西洋参都得到了参与三萜皂苷生物合成的候选CYP450全长基因序列。

Luo等^[37]对三七根进行了高通量测序，进而拼接、注释和扩增得到15个全长CYP450。其中Pn00158转录本与西洋参候选CYP450 contig00248转录本具有极高的相似性，并且与已进行功能确证的人参CYP716A47的氨基酸序列同源性高达97.95%；有7个CYP450属于CYP71家族，从系统进化关系角度分析Pn02132转录本与从大豆中鉴别的与皂苷元修饰有关的CYP93E1很近。由此推断Pn00158及Pn02132 2个转录本很可能是参与人参皂苷合成的候选CYP450。这些cDNA序列的GenBank登录号为GU997664～GU997678。

近年来利用新一代测序技术及生物信息学分析等方法，筛选出了参与人参皂苷生物合成的相关CYP450，并对候选基因进行了生物功能验证，进一步阐明了人参皂苷生物合成途径^[53]。Han等^[54]对MeJA诱导的人参不定根进行了转录组测序，通过拼接、注释及扩增得到9个候选CYP450全长基因。其中CYP716A47基因不仅可响应MeJA诱导的表达量上调，而且转入过量表达SS基因的转基因人参植株后能使人参根中皂苷的产量提高。将CYP716A47基因转入酿酒酵母后表达的重组蛋白能催化达玛烯二醇的C-12位羟基化使其转化为原人参二醇。将DS与CYP716A47同时转入酿酒酵母，重组菌株中检测到了原人参二醇的产生。该报道首次对参与人参皂苷合成的CYP450进行了功能确证。Chen等^[55]应用高通量454GS FLX测序技术进行了人参、西洋参和三七转录组研究，在大量的转录组数据中挖掘CYP450，为进一步筛选参与人参皂苷合成的CYP450提供了重要依据。Sun等^[50]对西洋参根进行了高通量测序，通过拼接、注释得到150个CYP450。选取其中转录水平最高的27个CYP450进行MeJA诱导实验，在根、茎、叶和花组织中仅contig00248转录本与DS表达模式一致。转录本contig00248在系统进化中与拟南芥CYP88家族较近。Han等^[56]从MeJA诱导的人参不定根EST文库中克隆到CYP716A53v2，将其转入酿酒酵母后表达的重组蛋白能催化原人参二醇的C-6位羟基化，使其转化为原人参三醇。上述关于五加科三萜皂苷相关CYP450的研究进展，大大推进了三萜皂苷生物合成途径的研究，也为通过合成生物学技术生产三萜皂苷的探索提供了重要的元器件。

皂苷由皂苷元与糖构成，根据苷元不同，可以分为甾体类皂苷和三萜类皂苷。PNS主要为三萜类皂苷，包括人皂苷Rb₁、人参皂苷Rg₁、三七皂苷R₁、人参皂苷Re等60余种。皂苷在生物体内合成的最后一步反应中，皂苷元被GT催化，将糖基转移到皂苷元上，最终形成皂苷，因此GT是三七皂苷、人参皂苷等天然皂苷合成的关键酶^{[41, 57, 58]}。另外，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶（UDP- glucuronosyltransferase，UGT）通过与植物激素的相互作用参与植物应激反应。Tognetti等^[59]研究表明，拟南芥中过氧化氢响应的UGT74E2通过影响植物激素吲哚丁酸（IBA）的活性参与植物结构和水胁迫应答的调控。Dong等^[60]最近的研究提出，脱落酸（ABA）的UGT71B6及其2个同系物通过参与ABA的结合途径，在ABA的稳态和应答各种非生物胁迫中起到至关重要的作用。此外，UGT还参与多种植物的防御反应^{[61, 62]}。

目前，植物中GT在三萜类皂苷合成过程中的作用得到了广泛研究，多种植物如罗汉果^[63]等克隆得了葡萄糖基转移酶基因的全长序列并实现了原核表达。向丽等^[64]通过分析三七转录组数据，发现3个GT转录本和与蒺藜苜蓿中的三萜糖基转移酶UGT73K1和UGT71G1的亲缘关系较近，推测其可能在三七皂苷最后一步合成中起催化作用，并对其中1条转录本（Pn02086）进行了基因全长克隆，得到1条开放阅读框为1 488 bp的cDNA序列，命名为PnUGT1。该基因编码495个氨基酸，蛋白相对分子质量为5.545 3×10⁴，属于不稳定蛋白。该蛋白不具有信号肽和跨膜区，最有可能定位在细胞质中。序列比对和进化关系分析表明，该蛋白和蒺藜苜蓿三萜合成相关的UGT AAW56092的亲缘关系较近，PSPG保守区域的相似性为66%。该基因在三七叶中表达量较在花、茎和根中的表达量高，推测PnUGT1基因可能属于三七GT家族。

Luo等^[37]对三七根进行了高通量测序，进而拼接、注释和扩增得到8个UGT全长序列。GenBank登录号为GU997656-GU997663。3种UGT包括Pn00082、Pn02086和Pn13895与蒺藜苜蓿2个三萜糖基转移酶UGT73K1和UGT71G1一致，其中由于Pn13895与UGT71G1较近的亲缘关系被当作最有可能参与三萜皂苷生物合成过程的候选UGT。郭淑^[65]通过分析上述已获得的三七转录组数据，利用RT-PCR方法克隆得到三七PnUGT02086和PnUGT13895基因的全长cDNA序列，并对这些基因所编码的蛋白进行了理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析。Pn00082未能成功克隆，可能是假基因。将PnUGT02086和PnUGT13895基因通过酶切连接到pET28a载体并转化表达菌株BL21，成功表达并纯化到了PnUGT02086和PnUGT13895蛋白，为进一步验证其功能奠定了基础。

邢朝斌等^[66]利用RT-PCR和RACE技术，从刺五加中分离出全长为1 959 bp的UGT基因cDNA序列，该基因开放阅读框为1 827 bp，编码1个含608个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析结果显示，该蛋白包含UGT家族的标志性序列，不存在跨膜区域，定位于细胞质中，属于参与植物次生代谢的UGT-B型。修乐山等^[67]以GAPDH基因为内参基因，采用RT-PCR技术分析不同产地、器官、时期和MeJA对刺五加UGT基因表达的影响，MeJA处理可显著提高UGT基因的表达量（P＜0.05）。不同产地、器官和时期的刺五加的UGT基因表达量和总皂苷量差异显著，但UGT基因的表达量与总皂苷量同升同降，存在极显著的正相关关系（P＜0.01）。初步判定，UGT基因的表达量决定了刺五加中总皂苷的量，UGT是决定刺五加中总皂苷量的关键酶。上述研究表明UGT是三萜皂苷碳骨架生物合成途径最后的关键酶。

随着对PNS生物合成相关关键酶的深入研究，SS、SE、CYP450等酶在不同器官、不同时期和受到MeJA刺激下的表达量均存在明显差异，这些酶的组织特异性可能是不同器官的总皂苷量不同的分子基础。另外SS、SE、GT等酶的基因多态性可能是优质三七形成的分子基础。Niu等^[68]克隆了参与三萜皂苷生物合成的PnFPS、PnSS、PnSE1、PnSE2和PnDS，并分析了相应蛋白的保守结构域和种系遗传学；用RT-PCR检测4年生三七不同器官和受到MeJA刺激后各基因的表达量，分析了其组织和器官特异性和表达模式；对达玛烷型三七皂苷生物合成的表达模式进行了全面分析，并为进一步阐明其分子机制和开发下游基因提供基础。

李珍等^[69]研究发现丹参CAS基因SmCAS的表达受低温和干旱等坏境因素显著影响。Nasrollahi等^[70]研究显示甘草SS和bAS不管是在幼苗期还是成年植株在干旱胁迫条件下基因表达水平均上调，并表明在干旱胁迫条件下参与三萜皂苷生物合成的关键酶的表达上调，并直接提高包括甘草酸在内的次生代谢产物产量。上述研究表明，三萜皂苷生物合成的关键酶受到环境因素的调控。

目前，对PNS生物合成过程中关键酶的相关调控研究还不够充分，对三七和同源或异源植物三萜皂苷合成途径中存在的调控进行分析，可推测PNS生物合成的相关调控因子。目前研究最深入的是转录水平的调控，相关转录因子（transcription factor，TF）陆续被发现，而调控因子是指能够特异性地结合在基因序列上的蛋白质，在植物应对发育程序和环境改变时调控基因的表达中发挥重要作用。

有研究报道西洋参中的皂苷合成途径是受MeJA诱导的^[71]。西洋参PqWRKY1基因在MeJA处理3 h后表达量升到最高，然后开始下降，这与参与皂苷合成的基因如达玛烷合成酶基因的诱导表达是一致的。PqWRKY1基因定位于细胞核，具有转录激活活性，是具有生物学活性的转录因子基因。有研究表明通过异源转化的方式可以鉴定非模式植物中WRKY类转录因子基因的功能。孙永珍^[72]研究表明，用PqWRKY1基因转化拟南芥，通过转化株系的基因表达、转化幼苗的抗逆性等来鉴定PqWRKY1基因在西洋参中的生物学功能。实验结果表明，转基因株系中三萜合成相关基因HMGR、FPS2、SS1和SE2的表达量均比对照转化株系的表达量高，这在其他WRKY转化研究中未见报道。对AtHMGR、AtFPS2、AtSQS1和AtSQE2的启动子区分析结果表明，这些基因的启动子区均存在可以和WRKY基因相结合的W-box。推测PqWRKY1基因可能直接或间接地结合三萜皂苷合成基因的启动子区，进而调控三萜皂苷合成基因的表达，这是西洋参中克隆和鉴定的第1个可能参与三萜皂苷合成调节的转录因子基因。

李娜等^[73]采用SEFA-PCR方法，以总DNA为模板，克隆了灵芝SS基因的启动子序列，长1 042 bp。序列分析发现灵芝鲨烯合酶基因启动子中没有明显的TATA和CAAT框，但是含有CCAA T-binding factor、GATA-1、GC-box、TFIID等重要的转录因子的结合位点。

Razdan等^[74]克隆和鉴定了催眠睡茄中1个SE的全长cDNA序列，并成功将WsSE克隆到pGEX4T-2载体中，并在大肠杆菌中表达。利用基因组位移法分离得到1个513 bp的WsSE启动子序列，用PLANT CARE和PLACE站点分析工具从WsSE启动子中破译了几个与植物生物和非生物应激反应有关的关键顺式调控元件。与翻译起始精确度相关的TATA-box定位在96 (−)；与组织特异性启动子活性相关的CAATBOX定位于226 (−)、299 (−)、497 (−)、144 (−)、511 (−)、149 (−)；钙响应顺式元件ABRERATCAL定位于240 (+)；与基于erd1表达的黄化现象相关的ACGTATERD定位于469 (+)；保守序列AMYBOX1和转录因子ARR1AT、ARR1、BIHD1OS结合位点OsBIHD1、CATA等都得到鉴别；还在启动子区域找到了与重要植物激素诱导调控相关的ABREOSRAB21 469 (+)、ARFAT 327 (+)、ASF1MOTIFCAMV 228 (+)、348 (−)、WRKY71OS 228 (+)，表明转录活性区域与植物激素有关。Dhar等^[42]克隆得到了催眠睡茄的3个全长OSC的cDNA序列，其中包括CAS序列，并用基因组步移法分离得到3个OSC的启动子，其中CAS的启动子长475 bp。通过用In silico工具分析启动子的PLACE和PlantCare数据库，从WsOSCs启动子中鉴别得到包括TATA box和一些参与基因调控的重要顺式作用元件，这些顺式作用元件与光响应、激素响应及多种应激反应有关。其中bZIP、GARE和Box-W1 3类调控元件被用来研究它们在诱导下对启动子诱导或抑制的调控。

Luo等^[37]以Inter-Pro自动预测的研究为基础，得到了代表分属于各个不同TF家族的公认同源序列的906个三七独特序列，包括ARF、AUX/IAA、B3、MYB、碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）、bZIP、Homeobox、Homeodomain-like/related、Pathogenesis- related/ERF、WRKY和锌指环家族蛋白。MYB、bZIP和WRKY转录因子的许多成员蛋白与应激反应的调节有关。454-EST数据库中三七最丰富的TF家族是以DNA结合域为特点的MYB家族蛋白，在拟南芥中，包含163个基因的MYB家族也是最大的TF家族^[75]。同源异型框蛋白是三七中另一种高表达的FT，同源框基因调节植物发育的多个方面，比如调控器官发生^[76]。三七中高表达的MYB和同源异型框蛋白可能与响应特定的生境和/或发育调控有关。由于TF在植物中的功能多种多样，三七中可能参与环境应答和发育调控的TF的生物学功能会在未来的研究中得到鉴别。

虽然与PNS合成相关的酶基因的克隆已经取得了一些进展，但随着对更多酶和在分子水平上调控的研究深入，认识到PNS生物合成调控，尤其是三萜皂苷碳骨架形成以后的后修饰过程的复杂性。最近的一些研究显示，从三七中得到了与人参β-AS匹配的2个单序列，看似与以前报道的三七中不存在齐墩果烷型皂苷相抵触，这可能与齐墩果烷型皂苷在三七中的量太低不能够被检测到，或者由于不存在齐墩果烷型皂苷生物合成的β-AS下游基因所致。

由于PNS种类较多且合成途径长而复杂，这使得控制PNS代谢流的遗传操作还存在一定困难。因此，未来的研究方向应该是进一步补充和完善PNS生物合成途径及其网络，开展更多关键酶及其基因的分离、克隆和表达特征的分析；明确相关酶基因表达的组织和发育的调控机制及对基因时空调控作用的各种顺式和反式作用因子，以实现对代谢途径中调控因子的合理应用和基因的协同转化；分离具有时空特异性表达功能的启动子，实现目的成分在特定组织和细胞中的定向和高效表达；通过基因工程技术实现目的化合物的工业化高效生产，可以有效缓解目前以PNS为主要成分的药用植物资源不足的现状，也为今后实现大规模生产PNS奠定基础。