2015, Vol. 46
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.19.018 |
2. 成都大学生物产业学院, 四川 成都 610106;
3. 四川金土地中药材种植集团有限公司, 四川 成都 611130
2. Department of Biological Engineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China;
3. Sichuan Jintudi Cultivation of Chinese Herbal Medicines Group Co., Ltd, Sichuan 611130, China
药用植物重楼为百合科植物云南重楼（滇重楼）Paris polyphylla Smith var. yunnanensis (Franch.) Hand.-Mazz和华重楼Paris polyphylla Smith var. chinensis (Franch.) Hara的干燥根茎[1]。甾体皂苷是重楼的主要活性物质，具有抗肿瘤、消炎、止血、抗氧化、促进子宫收缩和保护血管内皮细胞等药理作用，临床上内服用于止血、止痛、抗肿瘤，外用抗感染、抗炎镇痛等[2, 3, 4, 5]。而且是云南白药、宫血宁胶囊、季德胜蛇药片、抗病毒颗粒等产品的主要原料[6]。由于重楼具有多种药理作用且药效好，制药工业对重楼的需求量逐年递增，以致供不应求。巨大的需求缺口驱动药材价格飞涨，并进一步刺激药农滥采滥挖，使得道地产区野生重楼资源严重枯竭，濒临灭绝[6]，所以采用人工栽培重楼已势在必行。然而重楼植物种子具有自然繁殖率低，种胚发育不完全，胚乳坚硬和胚轴后熟等明显“双重休眠”的特性，重楼种子播种后通常需要经历2个冬天才能萌发，其成苗生长时间长，是典型的“二年生种子”[7]。重楼植物的个体发育过程十分缓慢，由种子萌发到开花结实，至少需4～5年，其中苗期（幼年期）可以持续4年以上[8]。因此，采用种子繁殖花费时间长且繁殖率低，较难大规模生产以满足人们对重楼药材的需求。
植物组织培养技术是可实现植株快速繁育的有效途径；但目前在重楼植物的组织培养研究中，取得的成功报道却甚少。现研究发现重楼植物的地上茎、根、叶和花蕾等外植体都不能诱导出愈伤组织，而采用幼芽诱导的愈伤组织生长缓慢，且不含原植物中的皂苷[9, 10, 11, 12]。王跃华等[13]研究发现，采用重楼植物的特定部位根茎，可成功地诱导出生长速度较快的愈伤组织，并且还发现了经过多次继代的愈伤组织中含有重楼皂苷。本研究采用华重楼根茎为外植体，在获得愈伤组织的基础上，进一步完成对不定芽的诱导与无根苗生根培养，采用正交试验方法筛选出培育华重楼组培苗的最佳条件，并进一步开展了炼苗和移栽条件研究，获得了华重楼再生植株的快速繁育方法，最终实现华重楼植物在短时间和低成本条件下大批量生产。
1 材料华重楼植物采自四川省都江堰，经四川大学张浩教授鉴定为百合科植物华重楼Paris polyphylla Smith var. chinensis (Franch.) Hara。本实验选取生长健康、无病虫害的华重楼植物根茎为外植体。
2 方法 2.1 愈伤组织诱导选取生长健康、无病虫害的华重楼植物的根茎，先用流水洗净泥土后吸干表面的水分，然后切除根茎上的不定根，再在超净工作台上切取根茎前端带芽体部分的第1个茎节，先用0.1%升汞消毒9 min，然后用无菌水冲洗5次后切除根茎上的芽体，最后将第1个茎节切成1.0 cm3大小后接入以MS为基本培养基附加不同质量浓度激素配比的愈伤组织诱导培养基中，采用3因素4水平（表 1）L16(43) 实验设计研究6-BA（A）、NAA（B）、2,4-D（C）3种激素对愈伤组织诱导的影响。外植体接入培养基后，先置于6 ℃冰箱中低温处理15 d，再转放在温度为22 ℃、每天光照6 h、光照强度为1 000 lx的条件下进行培养，培养55 d后统计其愈伤组织诱导率。
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表1 愈伤组织诱导因子水平表 Table1 Factors and levels of callus induction |
选取质地紧密、无褐变和玻璃化现象产生、颜色为黄白色的愈伤组织，将其切成2.0 cm3大小后接入以MS为基本培养基，并附加不同质量浓度激素和头孢曲松钠的不定芽诱导培养基中，采用4因素4水平L16(44)试验设计研究6-BA（D）、IAA（E）、KT（F）3种激素和头孢曲松钠（G）对不定芽分化的影响。愈伤组织接入培养基后，先在培养温度为10 ℃、每天光照2 h、光照强度为500 lx的条件下进行诱导培养30 d后，再转放在培养温度为20 ℃、每天光照10 h、光照强度为1 200 lx的条件下进行诱导培养，培养30 d后统计其不定芽诱导率。
2.3 不定根的诱导当不定芽长至1.0 cm以上时，将不定芽按1～2个为1组连同其基部的愈伤组织一同切下并转接到以1/2 MS为基本培养基附加不同质量浓度激素和活性炭的生根培养基中，采用3因素4水平L16(43)试验设计研究IBA（H）、NAA（I）2种激素和活性炭（J）对不定根产生的影响。外植体接入培养基后，在温度为20 ℃、每天光照4 h、光照强度为800 lx的条件下进行培养，培养55 d后统计其生根率。
2.4 炼苗和移栽选取生长健壮的组培苗从培养瓶中取出，先放在无菌水中，在温度为15 ℃、每天光照5 h、光照强度为500 lx的条件下栽培一段时间后，再移栽至松软土壤中，在温度为18 ℃、相对湿度80%、每天光照6 h、光照强度为800 lx的条件下培养，培养30 d后统计组培苗成活率。
所有培养基的pH值为6.0，琼脂6.5 g/L、蔗糖30 g/L。
2.5 数据分析利用正交助手II进行正交试验设计和数据分析。
3 结果与分析 3.1 愈伤组织诱导将准备好的外植体接入按正交试验（表 1）设计的培养基中，培养55 d后统计其愈伤组织诱导率，并对实验结果进行极差分析和方差分析，结果见表 2和3。
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表2 愈伤组织诱导L16(43) 正交试验设计与结果 Table2 Results of callus induction by L16(43) orthogonal test |
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表3 愈伤组织诱导结果方差分析 Table3 Variance analysis of callus induction |
由表 2结果可以看出，愈伤组织诱导率最高的是7号组合A2B3C4，即华重楼愈伤组织诱导的最佳培养基配方为MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 1.5 mg/L＋2,4-D 3.0 mg/L，经培养55 d后统计愈伤组织的诱导率最高为41.08%。
由表 2极差值（R）大小分析结果表明，影响愈伤组织诱导率高低因素依次为B＞C＞A，即培养基中NAA对愈伤组织诱导的影响最大，其次是2,4-D，影响最小的是6-BA。
从表 3的方差数据分析结果可见，本实验设置的3个因素中B和C 2个因素对实验结果有显著性影响。其中因素B检验值F＝20.636，F0.05(3, 3)＝9.280，F0.01(3, 3)＝29.500，F0.05＜F＜F0.01，因而因素B有显著影响（0.01＜P＜0.05）；因素C检验值F＝10.872，F0.05(3, 3)＝9.280，F0.01(3, 3)＝29.500，检验值F0.05＜F＜F0.01，说明因素C有显著影响（0.01＜P＜0.05）；因素B检验值F＝20.636大于因素C检验值F＝10.872，所以影响愈伤组织诱导率的最主要因素为培养基中NAA的质量浓度，其次为培养基中2,4-D的质量浓度，此结果与极差分析的结果相吻合。
李群等[14]以展叶时旺盛生长的根茎作外植体，其愈伤组织的诱导率最高为16.6%，并且诱导出的愈伤组织质地较疏松、易纤维化，失去增殖能力。本研究利用重楼植物的根茎为外植体，采用不同的培养基配方，并且将外植体接入愈伤组织诱导培养基之后先置于6 ℃的冰箱中低温处理，因为低温有促进根茎外植体细胞打破休眠和完成脱分化进行快速分裂的能力，可使愈伤组织诱导率最高达到41.08%，同时还具有防止褐化的作用。
3.2 不定芽的诱导将选取的愈伤组织（图 1-A），接入按正交试验设计（表 4）的培养基中，在2种条件下先后分别培养30 d后统计其不定芽诱导率，并对实验结果进行极差分析和方差分析，结果见表 5和6。
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A-根茎诱导产生愈伤组织 B-由愈伤组织诱导产生不定芽 C-不定芽诱导生根形成组培苗 D-移栽成活的华重楼幼苗 A-callus induced by roots B-adventitious buds induced by callus C-adventitious roots induced by adventitious buds to formation tissue culture seedling D-survival seedling of P. polyphylla var. chinensis by transplanting 图1 华重楼再生植株诱导及移栽过程 Fig.1 Inducing and transplanting of plant regeneration of P. polyphylla var. chinensis |
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表4 不定芽诱导因子水平表 Table4 Factors and levels of adventitious buds induction |
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表5 不定芽诱导L16(44) 正交试验设计与结果 Table5 Results of adventitious buds induction by L16(44) orthogonal test |
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表6 不定芽诱导结果方差分析 Table6 Variance analysis on adventitious buds induction |
由表 5结果可以看出，不定芽诱导率最高的是10号组合D3E2F4G3，即华重楼不定芽诱导的最佳培养基配方为MS＋6-BA 3.0 mg/L＋IAA 0.3 mg/L＋KT 1.0 mg/L＋头孢曲松钠300 mg/L，经培养60 d后统计不定芽的诱导率最高为49.05%。
由表 5极差R值大小分析结果表明，影响不定芽诱导率高低因素依次为D＞G＞E＞F，即培养基中6-BA对不定芽诱导的影响最大，其次是头孢曲松钠，影响最小的是KT。
从表 6的方差数据分析结果可见，本实验设置的4个因素中D和G 2个因素对实验结果分别有极显著和显著影响。其中因素D检验值F＝35.846，F0.01＝29.500，检验值F＞F0.01，因而因素D有极显著影响（P＜0.01）；因素G检验值F＝29.465，F0.05(3, 3)＝9.280、F0.01(3, 3)＝29.500，检验值F0.05＜F＜F0.01，说明因素G有显著影响（0.01＜P＜0.05）；所以影响不定芽诱导率的最主要因素为培养基中6-BA的质量浓度，其次为培养基中添加的头孢曲松钠的质量浓度，此结果与极差分析的结果相吻合。
刘萍等[15]研究报道，在组织培养过程中青霉素对愈伤组织的诱导、分化及试管苗的生长有很大影响，适宜质量浓度的青霉素对诱导叶片愈伤组织的产生有抑制作用，而对愈伤组织的分化有促进作用，对试管苗的生长也有促进作用，同时也促进根系的发育。青霉素和头孢曲松钠都是医用抗生素，本研究在不定芽诱导培养基中特别添加并研究了不同质量浓度头孢曲松钠对不定芽诱导的影响，结果表明添加适宜质量浓度的头孢曲松钠有促进华重楼芽分化的作用，这与刘萍等[15]的研究结果一致，说明适宜质量浓度的抗生素有激素的作用。
3.3 不定根的诱导当不定芽长至1.0 cm以上时（图 1-B），将不定芽连同其基部的愈伤组织一同切下并转接到按正交试验设计（表 7）的生根培养基中，培养55 d后统计其生根率，并对试验结果进行极差分析和方差分析，结果见表 8、9。
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表7 不定根诱导因子水平表 Table7 Factorsand levels of adventitious roots induction |
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表8 不定根诱导L16(43) 正交试验设计与结果 Table8 Results of adventitious roots induction by L16 (43) orthogonal test |
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表9 不定根诱导结果方差分析 Table9 Variance analysis on adventitious roots induction |
由表 8结果可以看出，不定根诱导率最高的是9号组合H3I1J3，即华重楼不定根诱导的最佳培养基配方为1/2 MS＋IBA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L＋活性炭0.5%，经培养55 d后统计不定根的诱导率最高为100%，培育的组培苗见图 1-C。
由表 8 R值大小分析结果表明，影响不定根诱导率高低因素依次为H＞J＞I，即培养基中IBA对不定根诱导的影响最大，其次是活性炭，影响最小的是NAA。
从表 9的方差数据分析结果可见，本实验设置的3个因素中H和J 2个因素对试验结果有极显著影响。其中因素H检验值F＝86.719，F0.01(3, 3)＝29.500，检验值F＞F0.01，因而因素H有极显著影响（P＜0.01）；因素J检验值F＝70.806，F0.01(3, 3)＝29.500，检验值F＞F0.01，说明因素J有极显著影响（P＜0.01）；因素H检验值F＝86.719大于因素J检验值F＝70.806，所以影响不定根诱导率的最主要因素为培养基中IBA的质量浓度，其次为培养基中添加的活性炭的质量分数，此结果与极差分析的结果相吻合。
杨丽云等[16]采用1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L＋IAA 0.5 mg/L的生根培养基，将分化出的芽切下，接种于培养基上进行根的诱导，在培养过程中芽的基部逐步褐化伸长成根茎状，培养60 d左右，在褐化伸长前端芽的基部可长出2～3条根，生根率为76.3%。本研究选择当不定芽长至1.0 cm以上时，将不定芽按1～2个为1组连同其基部的愈伤组织一同切下并转接到生根培养基中，由实验结果可以看出采用本研究所选择的培养基配方，不定根诱导率最低为79.63%，最高可达100%。本研究选择了和杨丽云等[16]研究中不同的培养基配方，并在培养基中特别添加了活性炭，由以上实验结果分析可以看出，培养基中添加的活性炭浓度对不定根的诱导有极显著的影响，可见培养基中加入活性炭可以促进不定根生长，提高不定根诱导率。
3.4 炼苗和移栽选取生长健壮的组培苗（图 1-C），先在无菌水中栽培一段时间（0、3、5、7 d），再移栽至土壤中，培养30 d后统计组培苗成活率，统计结果见表 10。
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表10 组培苗的移栽时期和水培时间对组培苗成活率的影响 Table10 Impact of tissue culture seedling survive rate by transplanting period and hydroponic time |
杨丽云等[16]在移栽时将根长为2～3 cm的芽取出，洗净培养基后移栽于腐殖质土中，置于18～20 ℃温度下，土壤湿度保持50%～60%，180 d左右芽可生长出土展叶，形成完整植株，出土展叶成活率为65%。本研究选取长出第一片叶且不定根长出4条以上的组培苗进行移栽，并且在移栽至土壤前先在无菌水中栽培一段时间，由表 10可以看出先在无菌水中栽培5 d后再移栽至土壤中成活率可高达100%。
由表 10中A1和A4可以看出，选取重楼组培苗移栽的时期非常重要，同样在移栽至土壤前先水培5 d的条件下，选还未长出第1片叶且不定根数少于2条的重楼组培苗，移栽后成活率仅为30.62%；而选长出第1片叶且不定根长出4条以上的重楼组培苗，成活率可达到100%。由A2可以看出，若组培苗从培养瓶中取出，不进行水培直接移栽至土壤，成活率较低，仅为56.12%；由A3～A5可以看出重楼组培苗在移栽到土壤前，在选定的培养条件下进行一定时间的水培后，可明显提高组培苗的成活率，使成活率高达90%以上；由A4可以看出，组培苗从培养瓶中取出先水培5 d后再移栽至土壤中效果最好，可使成活率高达100%。即应选择长出第1片叶且不定根长出4条以上的组培苗进行移栽，并且在移栽至土壤前应先在无菌水中栽培5 d，以提高组培苗的成活率。
4 讨论张翔宇等[17]利用组织培养来繁殖重楼的难度很大，只有芽段可成功诱导出植株，而茎尖、根茎和子房虽可诱导愈伤组织，都存在增殖、分化以及诱导率低等问题。本研究选择根茎上带芽体的茎节为外植体诱导愈伤组织，再在愈伤组织的基础上进一步完成其不定芽的诱导与无根苗生根，从而获得华重楼组培苗，解决了华重楼以组织培养技术获得再生植株难的问题，为华重楼优良品种的培育和组培苗的大量快速繁殖提供了一条新途径，可实现华重楼植物在短时间和低成本条件下大批量生产。
在不定根的诱导培育中，还发现选取的不定芽必须要连同其基部的愈伤组织一同切下后，再转接到生根培养基中才能最终培育出不定根，这可能是与华重楼植物的器官结构特点有关；因为华重楼植物的不定根主要都是从其根茎上长出的，而在华重楼组培苗培育过程中，其不定芽基部的愈伤组织是可进一步形成组培苗的根茎；所以，通过本实验研究可以得知，在华重楼组培苗的生根培养过程中，选取的不定芽需连同其基部的愈伤组织是非常重要的。
在华重楼组培苗移栽时，采用了先将组培苗用水培养一段时间后，再移栽至土壤中栽培的新方法，使组培苗的成活率大大地提高了。分析其原因可能是因为培育的华重楼组培苗自身结构特点决定了对水的需求，以及本研究筛选的适宜水培条件的结果。
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