2015, Vol. 46
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.17.004 |
2. 中国中医科学院 中药资源中心, 北京 100700
2. National Resource Center for Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China
广金钱草Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.为豆科山蚂蝗属植物，半灌木状草本，分布于福建、湖南、广西和广东等省区。其干燥地上部分入药，具有利湿退黄、利尿通淋之功效，可治疗黄疸尿赤、热淋、石淋、小便涩痛、水肿尿少等症[1]。作为防治尿石症的常用传统中药，广金钱草是一种有着显著药理作用、临床疗效及广阔开发前景的广东道地药材。植物化学研究表明广金钱草主要含有黄酮、生物碱、酚类、鞣质、多糖等成分[2]。现代药理研究已证实广金钱草总黄酮能明显增加小鼠心肌营养性血流量、在体狗冠脉及脑血流量和小鼠常压缺氧耐受力，可缓解家兔离体血管条痉挛；在体外还能显著抑制血小板聚集和血栓形成[3]。但是目前的研究都集中在广金钱草地上部分，对其种子的研究仅限于发芽实验和质量标准的初步建立。本实验通过测定广金钱草种子提取物中总黄酮的量及其对1,1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）的清除能力来评估其抗氧化活性，并对其化学成分进行系统分离鉴定，为广金钱草扩大药用部位、综合开发利用提供科学依据。从广金钱草种子醇提物的不同萃取部位共分离得到10个化合物，分别鉴定为豆甾醇（stigmasterol，1）、邻苯二甲酸二正丁酯（dibutyl phthalate，2）、儿茶素 [(+)-catechin，3]、苯甲酸（benzoic acid，4）、麦芽酚（3-hydroxy-2-methyl- 4-pyrone，5）、3-O-乙酰基-(−)-表儿茶素 [3-O-acetyl (−)-epicatechin，6]、阿福豆苷（afzelin，7）、3′-甲氧基-表儿茶素（3′-O-methyl-epicatechin，8）、山柰酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（kaempferol-7-O-β-D- glucopyranoside，9）、槲皮素- 3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside，10）。其中化合物4～6、8为首次从山蚂蝗属植物中分离得到，化合物2、3、7、9为首次从广金钱草中分离得到。
1 仪器与材料DLSB-10/10型低温冷却液循环泵（广州星烁仪器有限公司）；UV-2450紫外分光光度计（日本岛津公司）；FA2204B电子天平（上海精科天美科学仪器有限公司）；PHS-25型数字pH计（上海盛磁仪器有限公司）；Bruker AVANCE III 500 MHz型全数字化超导核磁共振波谱仪（瑞士Bruker公司）；液质联用仪Waters/Micromass Q-tof LC/MS/ MS（美国Waters公司）；薄层色谱硅胶GF254、柱色谱硅胶（100～200、200～300目）为青岛海洋化工厂生产；反相硅胶RP-C18（日本YMC公司）；Sephadex LH-20（GE healthcare Bio-Sciences）；山柰酚（成都普思生物科技有限公司，质量分数＞98.5%，批号F0440313）；维生素C（VC，天津市大茂化学试剂厂，质量分数＞99%，批号20130110）；DPPH（上海麦克林公司，批号C10009796）；石油醚、氯仿、正丁醇、乙醇等有机试剂均为分析纯（天津百世试剂公司）。
广金钱草种子购于广西玉林中药材市场，经广东药学院杨全教授鉴定为豆科植物广金钱草Desmodium styracifolium (Osb.) Merr. 的干燥成熟种子。标本（20121112DS）保存于广东药学院中药学院。
2 方法 2.1 样品的制备广金钱草干燥种子15 kg，粉碎后用95%乙醇回流提取3次，每次3 h，合并提取液，减压浓缩成浸膏，加适量蒸馏水混悬，依次用石油醚、氯仿和正丁醇多次萃取，各部分萃取液减压浓缩，得石油醚部位（34 g）、氯仿部位（171 g）、正丁醇部位（664 g）及水相部位（893 g）。
2.2 粗提物总黄酮的检测2.2.1 供试品溶液制备
分别精密称取氯仿萃取物63.5 mg、正丁醇萃取物45.2 mg、水相浸膏175 mg，以70%乙醇溶解，分别定容于25 mL量瓶中，4 ℃冷藏，待用。
2.2.2 对照品溶液制备
精密称取山柰酚5.0 mg，置于50 mL量瓶中，用70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。
2.2.3 总黄酮的测定参考并改进文献方法[4]，分别精密吸取“2.2.2”项下溶液0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL于10 mL量瓶中，先加入0.1 mol/L AlCl3溶液2 mL，摇匀放置6 min，再加入NaAc-HAc缓冲液（pH 5.2）1 mL，用70%乙醇定容，室温放置15 min，于417 nm处测吸光度（A）值。每个样品平行测定3次。以对照品质量浓度为横坐标（X），A为纵坐标（Y），绘制标准曲线。
精密量取“2.2.1”项下的供试品溶液各2 mL置于10 mL量瓶中，按照上述方法测定A值，由标准曲线计算萃取物中总黄酮的量。
2.3 抗氧化活性研究 2.3.1 DPPH储备液的配制精密称取DPPH 17.5 mg，用无水乙醇溶解并定容至50 mL，摇匀，4 ℃冷藏，备用。
2.3.2 VC溶液的配制
精密称取VC 241.8 mg，70%乙醇定容至50 mL，按一定浓度梯度依次稀释，再分别吸取VC溶液1.5 mL，按“2.3.4”项下方法测定。
2.3.3 供试品溶液的配制将“2.2.1”项下的各供试品溶液分别按照一定浓度梯度依次稀释，再分别吸取1.5 mL样品溶液，按照“2.3.4”项下方法测定。
2.3.4 自由基清除率测定方法参照Lee等[5]方法，改进的反应体系为比色管中依次加入不同质量浓度的样品溶液1.5 mL及“2.3.1”项下的DPPH乙醇溶液0.5 mL，70%乙醇补充体积至10 mL。室温避光30 min后，于519 nm处测A值，平行操作3次，按照公式和回归方程分别计算自由基清除率和半数清除率（IC50）。
DPPH清除率＝1－(Ai－Aj)/Ao
Ai为样品＋DPPH吸光度的平均值；Aj为样品溶液吸光度的平均值；Ao为DPPH吸光度的平均值 2.4 提取与分离取“2.1”项下石油醚浸膏（34 g）用硅胶柱色谱粗分，经石油醚-醋酸乙酯（9∶1→2∶8）梯度洗脱，得到8个部分（PE. 1～8）。PE. 6经硅胶分离得化合物1（55.1 mg）。PE. 7经硅胶分离得化合物2（5.7 mg）。PE. 8经硅胶、Sephadex LH-20分离纯化得化合物3（91.5 mg）。
氯仿浸膏（171 g）用硅胶柱色谱粗分，经氯仿-甲醇（10∶0→5∶5）梯度洗脱，得到6个部分（Ch. 1～6）。Ch. 1经硅胶、Sephadex LH-20分离纯化得化合物4（61.2 mg）、5（8.1 mg）。Ch. 2经硅胶、Sephadex LH-20分离纯化得化合物6（7.4 mg）。Ch. 3经过ODS反、正相硅胶、Sephadex LH-20分离纯化得化合物7（4.1 mg）。
正丁醇浸膏（664 g）经ODS反相硅胶柱色谱分离得到33个部分（Bu. 1～33）。Bu. 16经硅胶、Sephadex LH-20分离纯化得化合物8（8 mg）和9（5 mg）。Bu. 19经硅胶、聚酰胺、Sephadex LH-20分离纯化得化合物10（41.5 mg）。
3 结果 3.1 粗提物中总黄酮的量山柰酚标准曲线的回归方程为Y＝80.876 X＋0.022 0（R2＝0.999 7），在4～9 μg/mL质量浓度范围内线性关系良好。石油醚、氯仿、正丁醇和水相部位的总黄酮量分别为4.74、10.99、26.64和2.33 mg/g。
3.2 抗氧化活性以样品溶液质量浓度为横坐标（X），DPPH自由基清除率（Y）为纵坐标绘制曲线（图 1），并计算IC50值（表 1）。抗氧化活性测定结果提示广金钱草种子提取物具有一定的抗氧化活性，为探讨其抗氧化作用的物质基础，继续对种子的化学成分进行了系统分离。
 | 图 1 各样品对DPPH自由基清除力随质量浓度变化曲线Fig.1 DPPH scavenging curves of each sample with change of concentration |
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表 1 各样品对DPPH自由基的IC50 Table 1 Scavenging IC50 of each sample on DPPH free radical |
化合物1：无色针晶。1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 5.32 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-6), 5.13 (1H, dd, J = 15.0, 9.0 Hz, H-22), 5.00 (1H, dd, J = 15.0, 8.5 Hz, H-23), 3.57～3.47 (1H, m, H-3), 1.00 (3H, d, J = 5.0 Hz, H-21), 0.98 (3H, s, H-19), 0.82 (3H, d, J = 4.0 Hz, H-27), 0.79 (3H, t, J = 7.5 Hz, H-29), 0.78 (3H, d, J = 7.5 Hz, H-26), 0.67 (3H, s, H-18)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ: 37.2 (C-1), 31.6 (C-2), 71.8 (C-3), 42.3 (C-4), 140.7 (C-5), 121.7 (C-6), 31.9 (C-7), 31.9 (C-8), 50.1 (C-9), 36.5 (C-10), 21.1 (C-11), 39.7 (C-12), 42.2 (C-13), 56.9 (C-14), 24.4 (C-15), 28.9 (C-16), 55.9 (C-17), 12.0 (C-18), 19.4 (C-19), 40.5 (C-20), 21.2 (C-21), 138.3 (C-22), 129.3 (C-23), 51.2 (C-24), 31.9 (C-25), 21.1 (C-26), 19.0 (C-27), 25.4 (C-28), 12.2 (C-29)。以上数据与文献报道基本一致[6]，故鉴定化合物1为豆甾醇。
化合物2：无色油状液体，ESI-MS m/z: 301.14 [M＋Na]+，分子式C16H22O4。1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 7.70 (2H, dd, J = 3.5, 6.0 Hz, H-3, 6), 7.51 (2H, dd, J = 3.5, 5.5 Hz, H-4, 5), 4.29 (4H, t, J = 6.5 Hz, H-1′, 1″), 1.71 (4H, m, H-2′, 2″), 1.42 (4H, m, H-3′, 3″), 0.95 (6H, t, J = 7.0 Hz, H-4′, 4″)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ: 167.8 (C-1, 8), 132.1 (C-2, 7), 130.9 (C-4, 5), 128.9 (C-3, 6), 65.6 (C-1′, 1″), 30.5 (C-2′, 2″), 19.2 (C-3′, 3″), 13.7 (C-4′, 4″)。以上数据与文献报道基本一致[7]，故鉴定化合物2为邻苯二甲酸二正丁酯。
化合物3：白色粉末。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 9.23 (1H, s, 5-OH), 8.99 (1H, s, 3′-OH), 8.89 (1H, s, 4′-OH), 6.72 (1H, s, H-2′), 6.68 (1H, dd, J = 5.0, 8.0 Hz, H-6′), 6.60 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5′), 5.89 (1H, s, H-8), 5.69 (1H, s, H-6), 4.48 (1H, d, J = 7.0 Hz, H-2), 3.82 (1H, m, H-3), 2.65 (1H, dd, J = 5.0, 16.0 Hz, H-4a), 2.35 (1H, dd, J = 8.0, 16.0 Hz, H-4b)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ: 81.1 (C-2), 66.5 (C-3), 28.0 (C-4), 156.4 (C-5), 95.3 (C-6), 156.6 (C-7), 94.0 (C-8), 155.5 (C-9), 99.2 (C-10), 130.8 (C-1′), 114.6 (C-2′), 145.0 (C-3′, 4′), 115.3 (C-5′), 118.6 (C-6′)。以上数据与文献报道基本一致[8]，故鉴定化合物3为儿茶素。
化合物4：无色片状晶体。1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 10.71 (1H, brs, OH), 8.15 (2H, dd, J = 1.0, 8.5 Hz, H-2, 6), 7.63 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-4), 7.49 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-3, 5)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ: 172.5 (C=O), 129.3 (C-1), 130.2 (C-2, 6), 128.5 (C-3, 5), 133.8 (C-4)。以上数据与文献报道基本一致[9]，故鉴定化合物4为苯甲酸。
化合物5：无色针晶，分子式C6H6O3。1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 7.70 (1H, d, J = 5.0 Hz, H-6), 6.42 (1H, d, J = 5.0 Hz, H-5), 2.36 (3H, s, CH3)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ: 154.1 (C-2), 149.2 (C-3), 173.0 (C-4), 113.1 (C-5), 143.2 (C-6), 14.3 (CH3)。以上数据与文献报道基本一致[10]，故鉴定化合物5为麦芽酚。
化合物6：黄色油状物。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 11.04 (1H, s, 5-OH), 9.90 (1H, s, 7-OH), 8.93 (1H, s, 3′-OH), 8.91 (1H, s, 4′-OH), 6.69 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5′), 6.68 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2′), 6.56 (1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz, H-6′), 5.91 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 4.74 (1H, d, J = 6.5 Hz, H-2), 3.93 (1H, m, H-3), 2.59 (1H, dd, J = 5.0, 16.0 Hz, H-4a), 2.43 (1H, dd, J = 7.0, 16.0 Hz, H-4b), 1.32 (3H, s, CH3)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ: 170.2 (C-4), 160.0 (C-7), 159.9 (C-8a), 158.9 (C-5), 145.0 (C-4′), 145.0 (C-3′), 129.7 (C-1′), 117.9 (C-6′), 115.2 (C-5′), 114.1 (C-2′), 100.0 (C-4a), 95.0 (C-8), 94.7 (C-6), 81.4 (C-2), 65.4 (C-3), 26.2 (C-4), 14.1 (CH3)。以上核磁信号归属均经HSQC和HMBS谱确证。上述数据与文献报道基本一致[11]，故鉴定化合物6为3-O-乙酰基-(−)-表儿茶素。
化合物7：黄色无定形粉末。mp 196～198 ℃。盐酸-镁粉反应呈阳性。ESI-MS m/z: 431.095 4 [M－H]−，分子式C21H20O10。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 12.63 (1H, brs, 5-OH), 7.75 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-2′, 6′), 6.91 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-3′, 5′), 6.41 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.21 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 5.29 (1H, s, H-1″), 3.07～3.97 (4H, m, H-2″～5″), 0.78 (3H, d, J = 6.0 Hz, H-6″)。以上数据与文献报道基本一致[12]，故鉴定化合物7为阿福豆苷。
化合物8：浅棕色粉末。1H-NMR (500 MHz, CD3COCD3) δ: 7.19 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2′), 6.96 (1H, dd, J = 2.5, 8.0 Hz, H-6′), 6.80 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5′), 6.03 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 5.93 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 4.93 (1H, s, H-2), 4.22 (1H, m, H-3), 3.83 (3H, s, OCH3), 2.87 (1H, dd, J = 4.5, 16.0 Hz, H-4β), 2.77 (1H, dd, J = 3.5, 16.5 Hz, H-4α)；13C-NMR (125 MHz, CD3COCD3) δ: 79.6 (C-2), 66.9 (C-3), 29.5 (C-4), 157.6 (C-5), 96.1 (C-6), 157.2 (C-7), 95.8 (C-8), 157.7 (C-9), 99.8 (C-10), 132.2 (C-1′), 111.8 (C-2′), 146.8 (C-3′), 147.9 (C-4′), 115.2 (C-5′), 120.6 (C-6′), 56.3 (-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[13]，故鉴定化合物8为3′-甲氧基-表儿茶素。
化合物9：黄色针晶，mp 267～268 ℃。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 12.48 (1H, s, 5-OH), 10.15 (1H, s, 4′-OH), 8.10 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-2′, 6′), 6.93 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-3′, 5′), 6.78 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.37 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 5.12 (1H, d, J = 7.0 Hz, H-1″), 3.70～3.10 (6H, m, H-2″～6″)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ: 147.5 (C-2), 176.0 (C-4), 160.4 (C-5), 98.8 (C-6), 162.5 (C-7), 94.2 (C-8), 155.8 (C-9), 121.6 (C-1′), 129.7 (C-2′, 6′), 115.5 (C-3′, 5′), 159.4 (C-4′), 104.6 (C-1″), 60.9～77.7 (C-2″～6″)。以上数据与文献报道基本一致[14]，故鉴定化合物9为山柰酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
化合物10：黄色无定形粉末，ESI-MS m/z: 487 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 7.71 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-2′), 7.59 (1H, dd, J = 2.0, 8.5 Hz, H-6′), 6.87 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5′), 6.38 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.19 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 5.25 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-1″), 3.23～3.72 (6H, m, H-2″～6″)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 159.0 (C-2), 135.6 (C-3), 179.5 (C-4), 163.0 (C-5), 99.9 (C-6), 166.1 (C-7), 94.7 (C-8), 158.5 (C-9), 105.6 (C-10), 123.2 (C-1′), 116.0 (C-2′), 145.9 (C-3′), 149.8 (C-4′), 117.6 (C-5′), 123.1 (C-6′), 104.3 (C-1″), 75.7 (C-2″), 78.1 (C-3″), 71.2 (C-4″), 78.4 (C-5″), 62.5 (C-6″)。以上数据与文献报道基本一致[15]，故鉴定化合物10为槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
4 讨论现代医学研究已证实诸多疾病的发生和发展与自由基导致的机体细胞氧化损伤密切相关，因此从天然产物中寻找安全有效的抗氧化剂成为近年来的研究热点之一。本研究以抗DPPH自由基能力为指标，评价广金钱草种子醇提物不同萃取部位的抗氧化能力。抗氧化活性测定结果提示广金钱草种子提取物具有一定的抗氧化活性。由图 1可知，各萃取物对DPPH自由基的清除率随着质量浓度的增加逐步呈上升趋势，具有较好的量效关系。以IC50（达到DPPH清除率50%时抗氧化剂的质量浓度）值表示提取物对DPPH的清除能力：氯仿部位＞石油醚部位＞水相部位＞正丁醇部位。采用紫外分光光度法测定萃取物中总黄酮的量：正丁醇部位＞氯仿部位＞石油醚部位＞水相部位。氯仿、石油醚和水相提取物抗氧化能力与总黄酮的量呈正相关。正丁醇部位总黄酮的量最高，但其清除DPPH自由基的活性最弱。推测与广金钱草种子提取物的不同极性部位中所含主要抗氧化成分的种类、结构及量有关，此外各提取物对不同类型的自由基也有选择性作用。更深入的分离纯化工作以及多类型自由基模型的综合评价研究还有待进一步开展。
| [1] | 中国药典 [S]. 一部. 2010. |
| [2] | 梅全喜. 现代中药药理与临床应用手册 [M]. 北京: 中国中医药出版社, 2008. |
| [3] | 国家中医药管理局《中华本草》编委会. 中华本草 [M]. 上海: 上海科学技术出版社, 1999. |
| [4] | 刘 伟, 南光明, 李紫薇, 等. 响应面法优化新疆若羌大枣总黄酮提取工艺及抗氧化活性 [J]. 食品科学, 2012, 33(22): 123-126. |
| [5] | Lee Y L, Yang J H, Mau J L. Antioxidant properties of water extracts from Monascus fermented soybeans [J]. Food Chem, 2008, 106(3): 1127-1137. |
| [6] | 张大帅, 陈文豪, 陈光英, 等. 琼岛染木树的化学成分 [J]. 中国药学杂志, 2013, 48(12): 964-967. |
| [7] | 林大都, 刘嘉炜, 李武国, 等. 蒲桃茎化学成分及其体外细胞毒活性研究 [J]. 中草药, 2014, 45(14): 1993-1997. |
| [8] | 陈佳宝, 刘佳宝, 崔保松, 等. 南五味子根的化学成分研究 [J]. 中草药, 2015, 46(2): 178-184. |
| [9] | 谭国英, 张朝凤, 张 勉. 野生直立百部的化学成分 [J]. 中国药科大学学报, 2007, 38(6): 499-501. |
| [10] | 王久粉, 刘 丹, 钱士辉, 等. 中国红参化学成分的研究 [J]. 中国野生植物资源, 2011, 30(6): 55-56. |
| [11] | Li D L, Li X M, Peng Z Y, et al. Flavanol derivatives from Rhizophora stylosa and their DPPH radical scavenging activity [J]. Molecules, 2007, 12(5): 1163-1169. |
| [12] | 尚小雅, 李 帅, 王素娟, 等. 红绒毛羊蹄甲中的黄酮类成分 [J]. 中草药, 2009, 40(2): 196-199. |
| [13] | Okushio K, Suzuki M, Matsumoto N, et al. Identification of (-)-epicatechin metabolites and their metabolic fate in the rat [J]. Drug Metab Dispos, 1999, 27(2): 309-316. |
| [14] | 于志斌, 杨广义, 吴 晨, 等. 救心草的化学成分研究 [J]. 天然产物研究与开发, 2007, 19(1): 67-69. |
| [15] | 甘秀海, 赵 超, 梁志远, 等. 百尾参止咳活性成分研究 [J]. 中国中药杂志, 2013, 38(23): 4099-4102. |