五味子咀嚼片由五味子、丹参、野菊花、茯苓、香附组成，用于酒精性肝损伤的预防和治疗。目前已有五味子、丹参、野菊花、茯苓、香附单独的指纹图谱研究报道^{[1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9]}，但采用HPLC-DAD技术^[10]对同时含有这5种药材的药物指纹图谱研究尚未见报道。本实验建立了10批五味子咀嚼片的HPLC-DAD指纹图谱，相似度均大于0.90，并确认了五味子中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子乙素、五味子丙素；丹参中丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮II_A；野菊花中木犀草苷和蒙花苷，为五味子咀嚼片的鉴定及质量控制提供了科学依据。

LC-20A高效液相色谱仪，SPD-M20A二极管阵列检测器，SIL-10AF自动进样器，LC-15C二元梯度泵，LC-solution色谱工作站，日本岛津公司；AK-400A粉碎机，温岭市奥力中药机械有限公司；BT-25S天平，德国赛多利斯公司；HH-4数显恒温水浴锅，常州中捷实验仪器制造有限公司。

对照品五味子醇甲、五味子酯甲、五味子乙素、丹参素钠、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮II_A、原儿茶醛、木犀草苷和蒙花苷购于中国食品药品检定研究院，批号分别为110857-201309、111529-201306、110855-201412、110765-201005、111652-201311、110852-200806、110766-201012、110810-201007、111720-201408、11528-201308，质量分数均＞98%；对照品五味子醇乙和五味子丙素购于成都瑞芬思生物科技有限公司，批号分别为W-008-140801、W-009-140801，质量分数均＞98%。纯净水为超纯水，乙腈为色谱纯，其余均为分析纯。

五味子咀嚼片由吉林省公共医药平台有限公司生产，批号分别为20141001～20141010，编码为S1～S10。

色谱柱为Luna C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.05%磷酸水溶液，二元梯度洗脱：0～10 min，15%～20%乙腈；10～20 min，20%～35%乙腈；20～25 min，35%～60%乙腈；25～40 min，60%～70%乙腈；40～50 min，70%～50%乙腈；50～60 min，50%～90%乙腈；60～70 min，90%乙腈；柱温35 ℃，检测波长220 nm，体积流量1 mL/min，进样量20 μL。

取S3批五味子咀嚼片5片研磨成细粉（过80目筛），精密称取0.25 g，分别用10 mL 90%、70%、50%甲醇，水，90%、70%、50%乙醇7种不同溶剂溶解，滤过，滤液转移置10 mL棕色量瓶中，分别加入相应的溶剂定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。每种溶剂分别进样20 μL，对得到的色谱图进行比较，研究发现，50%甲醇提取效果优于其他溶剂，所得峰数量最多，峰形好，因此选择50%甲醇作为溶剂。

取同一供试品溶液，按上述洗脱梯度进行检测，比较220、254、286、334 nm检测结果，结果表明，220 nm得到的色谱峰数目较多，色谱峰峰形对称，不拖尾，与其他4个波长相比此波长为最佳检测波长，故选择220 nm作为检测波长。

精密称取各对照品适量，用甲醇分别溶解并定容至量瓶中，配成单个对照品储备液，分别精密量取各储备液适量，置同一棕色量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，配制成含五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子乙素、五味子丙素、丹参素钠、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮II_A、原儿茶醛、木犀草苷、蒙花苷质量浓度分别为57.0、47.5、36.0、49.6、52.3、47.0、64.0、26.0、110.0、24.0、38.0、62.0 μg/mL的混合对照品溶液，避光低温保存。

取S1～S10批五味子咀嚼片各5片研磨成细粉（过80目筛），精密称取0.25 g，加入50%甲醇约10 mL置锥形瓶中，超声，滤过，滤液转移至10 mL棕色量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

吸取“2.2.1”和“2.2.2”项溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，续滤液即为上样溶液。

取S3批五味子咀嚼片，按“2.2.2”项方法制备得供试品溶液，连续进样6次，进样量为20 μL，统计并计算所得谱图的相似度均大于0.99，相似度RSD小于0.33%，表明仪器精密度良好。

取S3批五味子咀嚼片按“2.2.2”项制备得供试品溶液，室温放置，分别于0、3、6、9、12、24 h进样，进样量为20 μL，计算所得谱图的相似度均大于0.98，相似度RSD小于1.50%，表明样品稳定性良好。

取S3批五味子咀嚼片6份，按“2.2.2”项制备得供试品溶液，按上述条件测定。6份样品所得谱图的相似度大于0.98，相似度RSD小于1.21%，证明此方法重复性良好。

采用中药指纹图谱相似度软件（2004A版）对10批不同批次的五味子咀嚼片指纹图谱数据进行处理，以S8样品为参照谱图，时间窗宽度为0.50 s，采用多点校正的方法生成指纹图谱。为保证不同批次五味子咀嚼片指纹图谱匹配时校正时间的准确性，选择了主要色谱峰作为校正的Mark峰。10批药材的HPLC-DAD指纹图谱及采用中位数法生成10批不同批次五味子咀嚼片的对照谱图（R），建立HPLC-DAD指纹图谱的共有模式，见图 1-A。

5-丹参素钠 9-原儿茶醛 11-木犀草苷 18-丹酚酸B 19-蒙花苷 23-五味子醇甲 26-五味子醇乙 31-五味子酯甲 33-隐丹参酮 36-丹参酮IIA 38-五味子乙素 39-五味子丙素 5-sodium danshensu 9-protocatechuic aldehyde 11-cynaroside 18-salvianolic acid B 19-buddleoside 23-schisandrin 26-schisandrol B 31-schisantherrin A 33-cryptotanshinone 36-tanshinone IIA 38-schisandrin B 39-schisandrin C图 1 10批五味子咀嚼片HPLC-DAD指纹图谱及R (A) 和混合对照品的HPLC-DAD图 (B)Fig. 1 HPLC-DAD fingerprint of 10 batches of SCCT(A) and HPLC of reference substance (B)

10批五味子咀嚼片经HPLC-DAD分离得到90多个色谱峰，比较测定的色谱峰，获得39个共有峰。共有峰经与对照品比对（图 1-B），保留时间、紫外吸收光谱（DAD检测器给出）均与对照品一致，确定了5号峰为丹参素钠、9号峰为原儿茶醛、11号峰为木犀草苷、18峰为丹酚酸B、19号峰为蒙花苷、23号峰为五味子醇甲、26号峰为五味子醇乙、32号峰为五味子酯甲、33号峰为隐丹参酮、36号峰为丹参酮II_A、38号峰为五味子乙素、39号峰为五味子丙素。23号共有峰（五味子醇甲）峰面积超过总峰面积的7.0%，结构稳定，分离度好，因此选五味子醇甲作为参比峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，测得10批产品与共有模式间的相似度依次为0.970、0.976、0.973、0.991、0.975、0.976、0.962、0.991、0.986、0.968，相似度均大于0.90，表明10批不同样品具有良好的相似性。

采用DAD检测器对同一供试品溶液在220、254、286、334 nm检测波长下色谱进行比较，220 nm（五味子酯甲、五味子乙素、五味子丙素最大吸收波长）波长下色谱峰数量多（59个，最小积分面积4万），分布均匀，峰形对称；254 nm波长下色谱峰数量较少（36个），10、24、25、29、30、34、39（五味子丙素）号色谱峰未积分（小于最小积分面积）；286 nm（丹酚酸B最大吸收波长）波长下色谱峰数量较少（34个），24、25、27、28、29、30、31、32（五味子酯甲）、34、35、37、39（五味子丙素）号色谱峰未积分；334 nm（蒙花苷最大吸收波长）波长下，只有前27 min有吸收峰（22个），选择334 nm作为检测波长不具代表性。确定检测波长为220 nm可较好地体现五味子咀嚼片中各味药材的化学成分特征。

五味子、丹参、野菊花阴性样品在五味子醇甲、五味子丙素、丹参酮II_A及木犀草苷的相应位置无色谱峰，其保留时间及紫外光谱与对照品的保留时间及紫外光谱一致。五味子中五味子醇乙、五味子酯甲和五味子乙素，丹参中丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B和隐丹参酮，野菊花中蒙花苷在阴性样品中相应位置有干扰峰，其保留时间与相应的对照品的保留时间接近，但其紫外光谱与相应的对照品的紫外光谱不一致，故上述物质也能得到确认。丹参和野菊花中均检测出原儿茶醛，故指纹图谱中9号色谱峰来自于丹参和野菊花。茯苓的主要成分为多糖及三萜类化合物，香附的主要成分为挥发油α-香附酮，分别对茯苓和香附水提浸膏进行液相色谱分析，结果表明茯苓和香附中所含色谱峰很少，并且吸光度低，故未能在指纹图谱中识别，已采用薄层色谱对2味药材进行鉴别。