柴胡Bupleuri Radix为伞形科（Umbelliferae）植物柴胡Bupleurum chinense DC. 或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Wild. 的根，始载于《神农本草经》，列为上品，具解表退热、疏肝解郁、升举阳气等功效^{[1, 2]}。现代药理研究表明，柴胡具有解热、抗炎、保肝、抗菌、抗病毒、促酶分泌、抗肿瘤、抗氧化、调节免疫、抗惊厥、促进细胞生长等诸多作用^[3]。柴胡的化学成分相当复杂，迄今为止已报道含有皂苷、黄酮、挥发油、甾醇、香豆素、有机酸、糖类、木脂素、生物碱及多炔类等成分^[4]。近年来，柴胡化学成分研究主要集中在皂苷类、挥发油、黄酮类和多糖^[5]，而针对多炔类成分的研究却未见报道。

目前，从其他属植物中分离得到的多炔类成分曾被研究者报道具有显著的生物活性。例如人参炔三醇和鬼针聚炔苷具有抗肿瘤活性^[6]；当归中的多炔成分有抗炎作用^[7]；苍术中分离得到的20余种聚乙炔类化合物，具有防止胃损伤、抗炎、利胆及黄嘌呤氧化酶阻碍等功效^[8]。近几年，柴胡属植物大叶柴胡中已提取分离得到17种多炔类化合物，其中柴胡毒素和乙酰柴胡毒素具有显著的神经毒性和细胞毒性^{[9, 10]}，而其他化合物的活性或毒性尚未见报道。本课题组前期研究发现南柴胡组成的逍遥散抗抑郁作用要优于北柴胡^[11]，逍遥散ig给予大鼠后20个血中移行成分多来自于柴胡，且多为多炔类化合物^[12]，因此本实验从柴胡石油醚部位中对其进行分离，得到4个多炔类化合物，分别鉴定为 (2Z,8Z,10E)-2,8,10-十五烷三烯-4,6-二炔-1-醇 [(2Z,8Z,10E)- pentadecatriene-4,6-diyn-1-ol，1]、(2Z,8E,10E)-2,8,10-十五烷三烯-4,6-二炔-1-醇 [(2Z,8E,10E)-pentadecatriene- 4,6-diyn-1-ol，2]、(2Z,8Z,10E)-2,8,10-十七烷三烯- 4,6-二炔-1-醇[(2Z,8Z,10E)-heptadecatriene-4,6-diyn- 1-ol，3]、柴胡炔醇（bupleurynol，4）。4个化合物两两互为顺反异构体，且以异构体组合物存在时较稳定；化合物1和3均为新化合物；采用UPLC的方法测定发现，不同产地和不同基原的柴胡中多炔类化合物的量存在较大差异。

Bruker 600 MHz Avance III NMR Spectrometer核磁仪（德国Bruker公司）；超高效液相色谱仪（ACQUITY PULCTM PDA，美国Waters）；Sartorius BSA124S分析天平；超声波清洗器（KQ5200E，昆山市超声仪器有限公司）；中草药万能粉碎机（FW135型，天津市泰斯特仪器有限公司）；微量移液器（200 μL，l mL，Thermo公司）；甲醇、乙腈为色谱纯，购自天津四有精细化学品有限公司，其余所有试剂均为分析纯，购自北京化工试剂公司；柱色谱硅胶（200～300目）和GF₂₅₄硅胶板（烟台江友硅胶开发有限公司）。

柴胡购自山西省华阳药业有限公司，经山西大学中医药现代研究中心秦雪梅教授鉴定为狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Wild. 和柴胡Bupleurum chinense DC.（供定量测定用），留样于山西大学中医药现代研究中心。

柴胡饮片以8倍量体积的95%乙醇回流提取2次，提取液浓缩所得浸膏用石油醚萃取，得到柴胡石油醚部位，称定质量，计算出膏率（3.9%）。取柴胡石油醚部位浸膏220 g，经硅胶（200～300目）柱色谱，石油醚-醋酸乙酯（100∶0→100∶100）梯度洗脱得30个组分，组分C17～C21浓缩合并，得到组分C-H（17.7 g）后，再经硅胶（200～300目）柱色谱分离，以石油醚-醋酸乙酯梯度洗脱，每流分200 mL，合并相同流分后得到组分C-H-1～C-H-30，其中组分C-H-8～C-H-9合并得组分C-H-X（8.9 g）。C-H-X（150 mg）经过Sephadex LH-20凝胶柱分离，以氯仿-甲醇（1∶1和1∶0）洗脱，得到C-H-X-LJ（63.9 mg）再经制备液相以85%甲醇-水系统洗脱得到化合物1（8.2 mg）、2（7.6 mg）、3（6.7 mg）、4（15.4 mg）。结构见图 1。

图 1 化合物1～4的结构Fig. 1 Structure of compounds 1—4

化合物1：无色结晶体（甲醇）。HR-ESI-MS测得准分子离子峰m/z: 215.139 1 [M＋H]⁺（计算值为215.139 1），推测相对分子质量为214，结合¹H-NMR和¹³C-NMR推测分子式为C₁₅H₁₈O，不饱和度为7。其紫外光谱与柴胡炔醇相同，在252、267、298、316和338 nm处有最大吸收波长，推断其中含有1个双烯-双炔-烯发色团^[13]。根据¹³C-NMR数据可知，该化合物有15个碳原子，且6个为烯碳（δ_C 105.0～145.9）、4个炔碳（δ_C 78.3～80.8）、5个脂肪碳（δ_C 13.8～61.3）。根据¹H-NMR中δ_H4.44 (2H,d,J = 6.4 Hz),6.23 (1H,dt,J = 10.8,6.3 Hz),5.68 (1H,d,J = 10.8 Hz) 数据，推测其结构为1个亚甲基与顺式碳碳双键相连，由数据δ_H 5.42 (1H,d,J = 10.5 Hz),6.51 (1H,dd,J = 10.5,10.8 Hz),6.59 (1H,dd,J = 15.6,10.8 Hz),6.01 (1H,dt,J = 15.6,7.1 Hz) 可知其结构为双烯键，且分别为顺式和反式，据0.90 (3H,t,J = 7.2 Hz,H-15) 可知，该处为烷基链末端甲基。经过二维相关谱信息分析，确定碳链连接顺序，综合以上数据，确定化合物1为 (2Z,8Z,10E)-2,8,10-十五烷三烯-4,6-二炔-1-醇，经过文献检索，为新化合物，命名为柴胡炔醇A，具体核磁数据见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 化合物1和3 的1H-NMR (600 MHz,CDCl3) 和13C-NMR (150 MHz,CDCl3) 数据 Table 1 1H-NMR (600 MHz,CDCl3) and 13C-NMR (150 MHz,CDCl3) data of compounds 1 and 3 碳位 化合物1 化合物3 δH δC δH δC 1 4.44 (2H,d,J = 6.4 Hz) 61.3 4.44 (2H,d,J = 6.8 Hz) 61.3 2 6.23 (1H,dt,J = 10.8,6.3 Hz) 145.9 6.26 (1H,dt,J = 10.8,6.7 Hz) 145.9 3 5.68 (1H,d,J = 10.8 Hz) 109.6 5.70 (1H,d,J = 10.8 Hz) 109.6 4 78.6 78.6 5 79.8 79.8 6 78.3 78.3 7 80.8 80.8 8 5.42 (1H,d,J = 10.5 Hz) 105.0 5.42 (1H,d,J =10.5 Hz) 105.0 9 6.51 (1H,dd,J = 10.5,10.8 Hz) 144.7 6.51 (1H,dd,J = 10.5,10.8 Hz) 144.5 10 6.59 (1H,dd,J = 15.6,10.8 Hz) 127.7 6.59 (1H,dd,J = 15.6,10.8 Hz) 127.8 11 6.01 (1H,dt,J = 15.6,7.1 Hz) 140.5 6.02 (1H,dt,J = 15.6,7.1 Hz) 140.5 12 2.19 (2H,q,J = 7.2 Hz) 32.9 2.20 (2H,m) 32.9 13 1.38 (2H,m) 31.6 1.38 (2H,m) 31.6 14 1.32 (2H,m) 22.5 1.29 (2H,m) 28.9 15 0.90 (3H,t,J = 7.2 Hz) 13.8 1.29 (2H,m) 28.8 16 1.29 (2H,m) 22.5 17 0.90 (3H,t,J = 6.8 Hz) 14.0

表 1 化合物1和3 的1H-NMR (600 MHz,CDCl3) 和13C-NMR (150 MHz,CDCl3) 数据 Table 1 1H-NMR (600 MHz,CDCl3) and 13C-NMR (150 MHz,CDCl3) data of compounds 1 and 3

化合物2：无色结晶体（甲醇）。HR-EI-MS m/z: 215.139 5 [M＋H]⁺（计算值为215.139 1），推测相对分子质量为214，结合¹H-NMR 和¹³C-NMR推测分子式为C₁₅H₁₈O，不饱和度为7。其紫外光谱和NMR数据与化合物1和柴胡炔醇非常相似，经过比较，根据¹H-NMR中5.57 (1H,d,J = 15.6 Hz),6.71 (1H,dd,J = 15.8,10.8 Hz) 数据可知，C8和C9之间的双键为反式。¹H-NMR (600 MHz,CDCl₃) δ: 4.44 (2H,d,J = 6.4 Hz,H-1),6.23 (1H,dt,J = 6.4,10.8 Hz,H-2),5.68 (1H,d,J = 10.8 Hz,H-3),5.57 (1H,d,J = 15.6 Hz,H-8),6.71 (1H,dd,J = 15.6,10.8 Hz,H-9),6.12 (1H,dd,J = 15.6,10.8 Hz,H-10),5.90 (1H,dt,J = 15.6,7.1 Hz,H-11),2.14 (2H,q,J = 7.2 Hz,H-12),1.38 (2H,m,H-13),1.32 (2H,m,H-14),0.90 (3H,t,J = 7.2 Hz,H-15)；¹³C-NMR (150 MHz,CDCl₃) δ: 61.2 (C-1),144.9 (C-2),109.7 (C-3),77.6 (C-4),79.9 (C-5),75.1 (C-6),83.1 (C-7),107.1 (C-8),145.7 (C-9),129.4 (C-10),140.7 (C-11),33.0 (C-12),31.7 (C-13),22.1 (C-14),13.8 (C-15)。通过文献检索，以上数据与文献报道一致^[14]，故鉴定化合物2为(2Z,8E,10E)-2,8,10-十五烷三烯-4,6-二炔-1-醇。

化合物3：无色结晶体（甲醇）。HR-EI-MS m/z: 243.170 1 [M＋H]⁺（计算值为243.170 4），推测该化合物的相对分子质量为242，结合¹H-NMR和¹³C-NMR推测分子式为C₁₇H₂₂O，不饱和度为7。其紫外光谱与柴胡炔醇相同，在252、267、298、316和338 nm处有最大吸收波长，推断其中含有1个双烯-双炔-烯发色团，根据¹³C-NMR数据可知，该化合物有17个碳原子，且6个为烯碳（δ_C 105.0～145.9）、4个炔碳（δ_C 78.3～80.8）、7个脂肪碳（δ_C 14.0～61.3）。根据¹H-NMR中δ_H4.44 (2H,d,J = 6.8 Hz),6.26 (1H,dt,J = 10.8,6.7 Hz),5.70 (1H,d,J = 10.8 Hz) 数据，推测其结构为1个亚甲基与顺式碳碳双键相连，由数据δ_H 5.42 (1H,d,J = 10.5 Hz),6.51 (1H,dd,J = 10.5,10.8 Hz),6.59 (1H,dd,J = 15.6,10.8 Hz),6.02 (1H,dt,J = 15.6,7.1 Hz) 可知其结构为双烯键，且分别为顺式和反式，据0.90 (3H,t,J = 7.2 Hz,H-15) 可知，该处为1个甲基。该化合物紫外光谱和NMR数据与柴胡炔醇非常相似，经过NMR数据对比发现，根据¹H-NMR中5.42 (1H,d,J = 10.5 Hz),6.51 (1H,d,J = 10.8 Hz) 可知，化合物3与柴胡炔醇为C₈和C₉位顺反异构对映体。经过二维相关谱信息分析，确定碳链连接顺序，综合以上数据，确定化合物3为(2Z,8Z,10E)-2,8,10-十七烷三烯-4,6-二炔-1-醇，为1个新化合物，命名为柴胡炔醇C。具体核磁数据见表 1。

化合物4：无色结晶体（甲醇）。HR-EI-MS m/z: 243.170 2 [M＋H]⁺（计算值为243.170 4），推出该化合物的相对分子质量为242，分子式C₁₇H₂₂O，不饱和度为7。¹H-NMR (600 MHz,CDCl₃) δ: 4.44 (2H,d,J = 6.8 Hz,H-1),6.26 (1H,dt,J = 10.8,6.7 Hz,H-2),5.70 (1H,d,J = 10.8 Hz,H-3),5.56 (1H,d,J = 15.5 Hz,H-8),6.70 (1H,dd,J = 15.6,10.8 Hz,H-9),6.11 (1H,dd,J = 14.8,10.9 Hz,H-10),5.89 (1H,dd,J = 14.8,7.3 Hz,H-11),2.15 (2H,m,H-12),1.39 (2H,m,H-13),1.29 (2H,m,H-14),1.29 (2H,m,H-15),1.29 (2H,m,H-16),0.89 (3H,t,J = 6.8 Hz,H-17)；¹³C-NMR (150 MHz,CDCl₃) δ: 61.2 (C-1),144.9 (C-2),109.7 (C-3),77.6 (C-4),79.9 (C-5),75.1 (C-6),83.1 (C-7),107.1 (C-8),145.7 (C-9),129.4 (C-10),140.7 (C-11),33.0 (C-12),31.7 (C-13),29.0 (C-14),28.9 (C-15),22.6 (C-16),14.0 (C-17)。通过文献检索，以上数据与文献报道一致^[13]，故鉴定化合物4为柴胡炔醇。

将制备得到的4个化合物的色谱峰分别收集，在自然条件下浓缩、放置，结果显示这4个化合物不能单独稳定存在，浓缩过程中发生互变现象，化合物1会得到比例为1∶1～1.5的组合物1，化合物2会得到比例为1∶2～4的组合物1；化合物3会得到比例为1∶1～1.5的组合物2，化合物4会得到比例为1∶2～4的组合物2。故将化合物1和2、3和4分别混合收集浓缩得到比例为1∶1～4的组合物1和组合物2，并对其稳定性进行考察。

经实验室多次试验考察结果发现，顺反式比例为1∶1～4时，2个月内于4 ℃且避光条件下保存稳定。长时间放置时会发生继续互变及降解现象。

称取各柴胡样品约5.0 g，加8倍量95%乙醇，提取2次，每次2 h，合并回流液，滤过，回收乙醇至无醇味，加水分散，浓缩至浸膏。将所得不同基原和不同产地柴胡药材浸膏加甲醇溶解于10 mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

分别称取分离所得的化合物1～4（质量分数分别为72.15%、94.99%、87.32%和96.76%）适量，精密称定，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得对照品储备液。分别精密量取各储备液适量，配成混合对照品，进样前0.22 μm微孔滤膜滤过。

色谱柱：BEH C₁₈柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为水（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～2 min，30%～40% B；2～4 min，40%～50% B；4～6 min，50%～55% B；6～9 min，55%～65% B；9～11 min，65%～75% B；11～13 min，75%～95% B；13～15 min，95%～30% B；体积流量0.5 mL/min；柱温40 ℃；进样量1 μL；检测波长315 nm。

分别取供试品溶液和对照品溶液依次测定，记录色谱图（图 2），结果表明该方法的系统适用性良好。

图 2 供试品 (A) 和对照品 (B) 溶液的UPLC色谱图Fig. 2 UPLC of samples (A) and reference substance (B)

精确量取对照品储备液，配成含化合物1质量浓度分别为29.9、14.95、2.99、1.49、0.59、0.29 μg/mL，含化合物2质量浓度分别为30.11、15.05、3.01、1.50、0.602、0.301 μg/mL，含化合物3质量浓度分别为13.9、6.95、1.39、0.695、0.278、0.139 μg/mL，含化合物4质量浓度分别为24.42、12.21、2.44、1.22、0.48、0.244 μg/mL的混合对照品溶液，按照上述色谱条件进行测定，以峰面积为纵坐标（Y），相应对照品的量为横坐标（X，μg）绘制标准曲线。化合物1～4线性方程分别为 Y＝8 484.5X－1 761.0，R²＝0.999 1；Y＝16 450 X－1 538.4，R²＝0.999 2；Y＝6 653.0X－756.88，R²＝0.999 3；Y＝28 963 X－3 135.1，R²＝0.999 3。线性范围分别为0.299～29.9、0.421～42.1、0.139～13.9、0.085～8.5 μg/mL。结果表明，化合物1～4在质量浓度范围内线性关系良好。

取上述对照品溶液，按上述色谱条件重复进样5次，每次1 μL，计算化合物1～4峰面积的RSD值，结果分别为0.81%、0.73%、0.55%和0.28%；表明该方法精密度良好。

取同一批样品5份，按“3.1”项制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算化合物1～4的平均质量分数及RSD值，结果平均质量分数分别为6.9、120.7、3.6、56.6 μg/g，RSD值分别为1.29%、0.97%、1.15%和0.11%；表明该方法重复性良好。

精密称取已知质量分数的柴胡样品5份，精密添加对照品溶液，按样品制备方法操作，测定并计算平均回收率及RSD值，结果化合物1～4的平均回收率分别为101.17%、100.53%、100.39%和99.99%；RSD值分别为1.29%、0.98%、1.15%和0.11%。

采用“3.1”项下方法制备供试品溶液，按照“3.3”项下色谱条件对不同产地及不同基原柴胡药材加以测定，定量测定结果见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 不同基原及不同产地柴胡中4种多炔类化合物的质量分数 Table 2 Contents of polyacetylenes in Bupleuri Radix from different bases and different habitats 基原植物 产地 质量分数/(μg·g-1) 1 2 3 4 总和 柴胡 山西-1 0 0 6.3 0.3 6.6 山西-2 15.3 175.0 6.6 49.7 246.6 陕西 4.2 80.2 3.7 39.0 127.1 四川 0 0 0 0 0 狭叶柴胡 内蒙-1 6.7 120.2 3.5 56.7 187.1 内蒙-2 0.8 0 18.4 0 19.2 河北 1.4 0 0 0.4 1.8

表 2 不同基原及不同产地柴胡中4种多炔类化合物的质量分数 Table 2 Contents of polyacetylenes in Bupleuri Radix from different bases and different habitats

本实验从柴胡药材石油醚部位中，分离纯化得到4个多炔类化合物，其中化合物1和3均为新化合物，两两互为顺反异构体，且极易发生互变现象，以顺反式比例为1∶1～4的组合物保存更稳定，该研究为柴胡中多炔类化合物的定量及活性研究提供了物质基础。

从基原角度分析，不同基原的柴胡中多炔类化合物的量存在较大差异；从产地角度分析，不同的产地可引起同一基原柴胡中多炔类化合物的量变，这一结果为柴胡药材的选用提供了一定的依据，不同基原及不同产地对柴胡中多炔类化合物量的具体影响，还需后期对大量样本进行进一步的测定分析。