丁桂活络膏（批准文号：川药制字Z20080855）原为橡胶膏剂，主要含羌活、延胡索、独活、当归、没药、木香、丁香、肉桂、红花、川芎、续断、细辛等中药，作为四川省骨科医院医院制剂治疗运动损伤、扭伤、关节疼痛、肌肉酸楚等病症疗效显著，作为防治运动伤病的常用药在多个国家级运动队广泛使用，但橡胶膏剂易致过敏、透气性差，笔者应用现代新技术，将其制成凝胶膏剂^[1]，以改善不良反应，提高疗效。本实验以方中君药羌活的有效成分羌活醇为评价指标，采用Strat-M膜及改进的Franz扩散池进行体外透皮试验^{[2, 3]}，比较了丁桂凝胶膏剂与丁桂活络膏透皮吸收特性的差异。

Waters 1525高效液相色谱仪，Empower III色谱工作站，2707自动进样器，2487紫外检测器，美国Waters公司；TT-6D透皮扩散仪，天津市正通科技有限公司；BS110S分析天平，Sartorius公司；超纯水机，美国艾科浦公司。

羌活醇对照品，中国食品药品检定研究院，质量分数99.8%，批号111820-201303；部分被中和的聚丙烯酸钠（NP700），批号350170A，日本昭和电工株式会社；丁桂凝胶膏剂，自制，批号20140709；丁桂活络膏，四川省骨科医院生产，批号140503；Strat-M膜，批号K4BA1004，美国Merck Millipore公司；乙腈（批号135189）、甲醇（批号137467），色谱纯，Fisher公司；其他试剂为分析纯。

将NP700加入甘油中搅拌均匀，为A相；将卡波姆941分散于水中充分溶胀，随后加入酒石酸，再加入甘羟铝，为B相；将处方药物用8倍量70%乙醇提取2次，浓缩成相对密度为1.18的浸膏，将浸膏加入A相中，再将B相缓慢加入A相，并滴加三乙醇胺至中性，混合搅拌均匀，涂布后盖上防粘层，保存。以制剂中羌活醇的量为质控指标。另称取不含羌活的处方药物按上述方法制成阴性丁桂凝胶膏剂样品。

色谱柱为Waters SymmetryShield RP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水（60∶40）；检测波长为310 nm，体积流量为1.0 mL/min。理论板数按羌活醇峰计算应不低于5 000。

精密称取-4 ℃保存的羌活醇对照品适量，加甲醇制成质量浓度为60 μg/mL的储备液，备用。精密量取该储备液，加甲醇分别稀释成质量浓度分别为0.029 3、0.117 2、0.468 8、1.875、7.5、30、60 μg/mL的系列对照品溶液，取20 μL进样，测定峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），羌活醇进样量为横坐标（X），绘制标准曲线并计算得回归方程为Y＝48 973.3 X－7 831.2，r＝0.999 8，表明羌活醇在0.586～1 200 ng与峰面积成良好线性关系。

取丁桂凝胶膏剂或丁桂活络膏1.0 g，精密称定，放入250 mL圆底烧瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，称定质量，热回流提取60 min，冷却至室温，再称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，吸取上清液，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，得供试品溶液。取阴性丁桂凝胶膏剂1.0 g，精密称定，同法制得阴性样品溶液。

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定。结果供试品色谱中羌活醇峰分离度良好，柱效高，且阴性样品色谱中在与羌活醇峰相同保留时间处无干扰色谱峰。见图 1。

图 1 羌活醇对照品 (A)、丁桂凝胶膏剂 (B)、丁桂活络膏(C) 和阴性丁桂凝胶膏剂 (D) 的HPLC图 Fig.1 HPLC of notopterol reference substance (A),DGP (B),DHRP (C),and negative sample of DGP (C)

精密吸取“2.2.2”项下的对照品储备液20 μL，重复进样6次，以羌活醇的峰面积计算RSD，其值为0.90%，表明在此条件下仪器精密度良好。

取批号20140709样品6份，按“2.2.3”项下方法制成供试品溶液，进行定量测定，测得羌活醇的平均质量分数为1.041 mg/g，RSD值为2.68%，表明样品重复性良好。

按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取新制备的供试品溶液，分别于配制后0、1、2、4、6、12、24、48 h进样，测得羌活醇峰面积的RSD值为1.84%，表明样品在48 h内稳定。

精密称取4.50 mg的羌活醇对照品，至25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度。取丁桂凝胶膏剂0.5 g，精密称定，放入250 mL圆底烧瓶中，精密加入羌活醇对照品溶液2.5 mL，按照“2.2.3”项方法制备供试品溶液，平行制备6份，测定样品中羌活醇的量，结果表明羌活醇的平均回收率为102.49%，RSD为2.43%，表明本方法加样回收率能满足要求。

参考《中国药典》2010年版附录XD第三法浆碟法及文献方法^[5]进行体外释放度实验，将凝胶膏剂剪成圆片，大小与供给池平面相同，贴于0.8 μm的微孔滤膜上，然后将微孔滤膜贴于供给池与接收池之间，加入接收液至刻度线，注意排除气泡。接收液为12 mL 30%乙醇的生理盐水溶液，磁力搅拌速率为600 r/min，水浴温度为（37.0±0.1）℃。分别于1、2、4、6、8、12、24、48 h取样，每次取样2 mL，同时补加2 mL接收液。样品溶液用0.45 μm滤膜滤过，HPLC法测定其中羌活醇的量，并按下面的公式计算累积释放度（L_n′）。

丁桂活络膏实验方法与凝胶膏剂相同，丁桂活络膏中W为0.579 2 mg。结果见表 1和图 2。由图 2可知，丁桂凝胶膏剂的释放速率由快至慢，再变快，总体上比橡胶膏剂稍快，至48 h两种剂型的L_n′分别为85.34%、67.87%，凝胶膏剂基质的释药性能比橡胶膏剂稍好，推测可能是橡胶膏剂基质中橡胶、松香等物质对有效成分的吸附较强所致。

表 1(Table 1)

表 1 Ln′结果 (x±s, n=6) Table 1 Results of cumulative release rate in vitro(x±s, n=6) t/h 丁桂凝胶膏剂 丁桂活络膏 Ln′/% RSD/% Ln′/% RSD/% 1 4.61±0.059* 1.288 2.24±0.022 0.967 2 10.64±0.150 1.415 8.36±0.099 1.183 4 18.97±0.240* 1.266 10.22±0.195 1.907 6 24.82±0.359* 1.445 14.14±0.205 1.447 8 26.90±0.394* 1.466 20.21±0.435 2.155 12 39.04±0.696* 1.783 32.54±0.945 2.903 24 54.82±1.425 2.599 50.39±1.126 2.234 48 85.34±1.819* 2.131 67.87±1.988 2.930 凝胶膏剂与橡胶膏剂比较：*P＜0.01 Comparison on gel paste and rubber patch P < 0.01

表 1 Ln′结果 (x±s, n=6) Table 1 Results of cumulative release rate in vitro(x±s, n=6)

图 2 丁桂凝胶膏剂与丁桂活络膏Ln′对比曲线图 Fig.2 Comparison on curves of release rate between gel paste and rubber patch

将凝胶膏剂剪成圆片，大小与供给池平面相同，贴于Strat-M膜上，然后将Strat-M膜装在供给池与接收池之间，加入接收液至刻度线，注意排除气泡。接收液为12 mL 30%乙醇的生理盐水溶液，磁力搅拌速度为600 r/min，水浴温度为（37.0±0.1）℃。分别于1、2、4、6、8、12、24、48 h取样，每次取样2 mL，同时补加2 mL接收液。样品溶液用0.45 μm滤膜过滤，HPLC法测定其中羌活醇的量，并按下面的公式计算累积透皮量（Q_n）、累积透皮率（L_n）。

以L_n对时间t作线性回归，所得直线斜率即为透皮速率常数（J）。丁桂活络膏实验方法与凝胶膏剂相同，丁桂活络膏中W为0.579 2 mg。结果见表 2、3和图 3、4。

通过SPSS 17.0软件进行t检验，根据表 2、3可知，自4 h后的每个时间点，丁桂凝胶膏剂与丁桂活络膏两者的累积透皮量和累积透皮率相比较，P值均小于0.01，具有显著性差异。

表 2(Table 2)

表 2 Qn结果 (x±s, n=6) Table 2 Results of Qn(x±s, n=6) t/h 丁桂凝胶膏剂 丁桂活络膏 Qn/μg RSD/% Qn/μg RSD/% 1 — — — — 2 15.3± 0.1 0.751 16.8±0.1 0.944 4 65.7± 0.4* 0.664 31.8±0.3 1.023 6 129.6± 1.3* 0.969 49.9±0.6 1.361 8 180.9± 2.3* 1.282 68.0±1.1 1.550 12 292.9± 3.5* 1.210 97.6±1.9 1.993 24 505.8± 7.2* 1.415 137.1±2.9 2.097 48 661.8±11.1* 1.677 181.6±4.2 2.289 “—”为羌活醇的量过低未检出；凝胶膏剂与橡胶膏剂比较：*P＜0.01 “—” means notopterol is too low to determine; Comparison on gel paste and rubber patch P < 0.01

表 2 Qn结果 (x±s, n=6) Table 2 Results of Qn(x±s, n=6)

表 3(Table 3)

表 3 Ln结果 (x±s, n=6) Table 3 Results of Ln(x±s, n=6) t/h 丁桂凝胶膏剂 丁桂活络膏 Ln/% RSD/% Ln/% RSD/% 1 — — — — 2 1.52±0.011 0.751 2.89±0.027 0.944 4 6.51±0.043* 0.664 5.50±0.056 1.023 6 12.86±0.125* 0.969 8.61±0.117 1.361 8 17.95±0.230* 1.282 11.74±0.182 1.550 12 29.06±0.352* 1.210 16.86±0.336 1.993 24 50.19±0.710* 1.415 23.67±0.496 2.097 48 65.67±1.101* 1.677 31.35±0.718 2.289 “—”为羌活醇的量过低未检出；凝胶膏剂与橡胶膏剂比较：*P＜0.01 “—”means notopterol is too low to determine; Comparison on gel paste and rubber patch P < 0.01

表 3 Ln结果 (x±s, n=6) Table 3 Results of Ln(x±s, n=6)

以透皮率L_n对时间t对作图，丁桂凝胶膏剂的透皮曲线方程为L_n＝9.208 t－18.50，r＝0.948，J＝0.092 08 h^-1，丁桂活络膏的透皮曲线方程为L_n＝4.285 t－6.704，r＝0.977，J＝0.042 85 h^-1。由图 3可知，丁桂凝胶膏剂的透皮量较丁桂活络膏更高，其中，1～12 h阶段，橡胶膏剂的Q_n增加缓慢，12～48 h阶段稍有加快，而凝胶膏剂自2 h起的Q_n一直快速增加，至48 h已达橡胶膏剂的3.6倍。由图 4可知，在第4、6、8、12、24小时，凝胶膏剂的L_n分别为橡胶膏剂的1.2、1.5、1.5、1.7、2.1倍，48 h的L_n为橡胶膏剂的2.1倍。

图 3 丁桂凝胶膏剂与丁桂活络膏Qn对比曲线图 Fig.3 Comparison on curves of Qn between gel paste and rubber patch

图 4 丁桂凝胶膏剂与丁桂活络膏Ln对比曲线图 Fig.4 Comparison on curves of Ln between gel paste and rubber patch

由实验结果可知，丁桂凝胶膏剂的透皮率及透皮量均优于丁桂活络膏，且与其他外用制剂相比，凝胶膏剂具有透气性好、过敏率低、使用方便、患者依从性高等特点，该剂型已展现出较高的临床应用价值^{[5, 6]}。

目前报道的国内离体透皮试验中多采用各种自制的动物皮肤^{[7, 8, 9]}，由实验者在临用前自己动手制备，其质量稳定性难以保证，此外，不论剔除还是化学试剂脱毛都可能对皮肤造成影响，还未见报道既能很好地模拟人的皮肤又具有很高的数据重现性的透皮屏障。本研究采用的Strat-M膜为美国Merck Millipore公司开发的人造膜，与各种动物皮肤相比，它的透皮性能都更接近人的皮肤，实验数据重现性也更好，国外已有研究者使用^{[10, 11, 12]}。

羌活醇为香豆素类化合物，为了使羌活醇在接收液中充分溶解，在预试验中分别以蒸馏水、生理盐水、30%乙醇生理盐水溶液、30% PEG 400生理盐水溶液为接收介质进行体外透皮试验，比较不同接收介质的差异，结果发现以30% 乙醇生理盐水溶液为接收液时，羌活醇的溶解性最好。由于凝胶膏剂以高分子化合物作为基质，且与金属离子交联后呈网状结构，故其释药较难^[13]，本实验加入了由氮酮、丙二醇、薄荷脑等组成的复合透皮吸收促进剂^{[14, 15]}，透皮效果较好。

结合释放度与体外透皮试验可以发现，凝胶膏剂的释放度为85.34%，透皮率为65.67%，其释放的有效成分中76.95%能被吸收；而橡胶膏剂的释放度为67.87%，透皮率为31.35%，其释放的有效成分中仅有46.19%能被吸收，说明在复合促透剂的作用下，凝胶膏剂中有效成分透过皮肤屏障的能力更优。综上，丁桂凝胶膏剂无论在释放还是透皮方面的性能均明显优于丁桂活络膏，且不易过敏，应用前景广阔。