2015, Vol. 46
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.14.022 |
2. 贵州昌昊中药发展有限公司, 贵州 凯里 556000
, ZHENG Chuan-zhu1, ZHANG Li1, LAN Cai-wu2, HE Ding-xiang2, YAO Wei-feng1, SHANG Er-xin1, DING An-wei1
2. Guizhou Changhao Chinese Medicine Development Co., Ltd., Kaili 556000, China
何首乌为蓼科（Polygonaceae）植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb. 的干燥块根。有生首乌和制首乌之分。生首乌苦泄性平兼发散，具有解毒消痈、润肠通便、截疟的功能。制首乌味甘厚性温，具有补肝肾，益精血、乌须发、强筋骨的作用[1]。现代研究表明，何首乌中主要含有二苯乙烯苷、蒽醌类及磷脂类等活性成分[2]，其中二苯乙烯苷因具有抗衰老、降低胆固醇、提高免疫功能、防止动脉硬化、保护肝脏[3]等作用，故《中国药典》中将其作为何首乌定量的控制标准。何首乌主产于贵州、四川、云南、湖北、广东、广西、湖南、江苏、河南等地，规格等级复杂，加之采收时间、炮制加工、贮存等因素的制约，故在功效、作用上存在一定的差异，仅凭个别化学成分的量难以全面反映药材的质量，目前，有很多文献研究何首乌的指纹图谱，但是仍然存在共有峰数目较少、不能全面地评价何首乌的质量，缺乏对共有峰进行定性等问题。本实验以HPLC法建立何首乌的HPLC指纹图谱，并应用主成分分析对实验数据进行处理，同时采用HPLC/Q-TOF-MS和对照品对照对何首乌共有峰进行归属，用于全面评价何首乌的质量。
1 仪器与试药 1.1 仪器Agilent1290高效液相色谱仪，配1260 DAD检测器；Agilent1260高效液相色谱仪，配1260 DAD检测器；Waters2695高效液相色谱仪，配2998PDA检测器；Triple Q-TOF 5600质谱仪（AB公司），配备电喷雾离子源系统，岛津高效液相LC-20AD；电子天平AY220（0.1 mg，江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂），DK-S22电热恒温水浴锅（上海精密实验设备有限公司）。
1.2 药材和试剂16批生何首乌药材Polygoni Multiflori Radix由贵州昌昊中药发展有限公司提供，产地见表 1。经南京中医药大学段金廒教授鉴定为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb. 的干燥块根。
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表 1 样品来源 Table 1 Sources of samples |
二苯乙烯苷、大黄素甲醚、大黄素对照品购自中国食品药品检定研究院，批号分别为110844-201310、110758-201415、110756-200110；乙腈为色谱纯（美国Merck公司），甲醇为色谱纯（江苏汉邦公司），甲酸为色谱纯（美国ACS公司）。
2 方法与结果 2.1 色谱条件及质谱条件 2.1.1 色谱条件AgilentExtend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，检测波长280 nm；柱温30 ℃；体积流量1.0 mL/min；进样量10 μL，流动相为0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱条件为0～30 min，8%～30% A；30～55 min，30%～70% A；55～65 min，70%～80% A；65～70 min，80%～100% A；70～75 min，100% A；75～80 min，100%～8% A；80～85 min，8% A。
2.1.2 质谱条件采用TOF MS-IDA-MS/MS模式，ESI负离子模式，扫描范围m/z 100～1 200，喷雾电压4 500 eV，离子源温度500 ℃，气帘气（CUR N2）0.20 MPa，雾化器（GS1 N2）0.38 MPa，辅助气 0.38 MPa，去簇电压（DP）80 eV IDA条件下设置：碰撞电压（CE）35 eV，碰撞电压差（CES）15 eV，开启动态背景扣除。
2.2 对照品溶液的制备 2.2.1 二苯乙烯苷对照品溶液的制备精密称取二苯乙烯苷对照品11.85 mg，置50 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，即得。
2.2.2 大黄素对照品溶液的制备精密称取大黄素对照品约8.25 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得。
2.2.3 大黄素甲醚对照品溶液的制备精密称取大黄素甲醚对照品4.50 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得。
2.3 供试品溶液的制备取本品粉末（过四号筛）约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇30 mL，称定重量，加热回流45 min，放冷，再称定质量，用75%甲醇补足损失的质量，摇匀，静置，上清液滤过，取续滤液，即得。
2.4 方法学考察 2.4.1 稳定性试验取何首乌样品，按供试品溶液的制备方法制备，分别于0、2、4、8、12、16 h依法进行测定，考察色谱峰相似度的一致性，利用中药指纹图谱相似度评价系统研究版（2012）进行相似度评价。结果各共有峰相对保留时间及相对峰面积RSD均＜3%，表明16 h内供试品溶液的成分是稳定的。
2.4.2 精密度试验取何首乌样品，按供试品溶液制备方法制备溶液，依法连续进样6次，利用中药指纹图谱相似度评价系统研究版（2012），进行相似度评价。结果各共有峰相对保留时间及相对峰面积RSD均＜3%，表明仪器精密度良好。
2.4.3 重复性试验取何首乌样品，按供试品溶液制备方法平行制备供试品溶液6份，依法检测，利用中药指纹图谱相似度评价系统研究版（2012），进行相似度评价。结果各共有峰相对保留时间及相对峰面积RSD均＜3%，表明重复性良好。
2.5 何首乌中二苯乙烯苷的测定取何首乌粉末0.2 g，按照《中国药典》2010年规定方法[1]测定16批何首乌中二苯乙烯苷量，其结果都达到了《中国药典》2010年版要求，结果见表 2。
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表 2 16批何首乌中二苯乙烯苷量 Table 2 Content of 2,3,5,4’-tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glucoside of 16 batches of samples |
取16批何首乌，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定。
2.6.1 共有峰的确定根据16批何首乌药材高效液相分析，发现18个共有峰，构建了何首乌HPLC色谱图的特征指纹图谱，作为何首乌鉴别的依据，由于二苯乙烯苷在各批次何首乌中均有出现，分离度良好且峰面积较大，故选择二苯乙烯苷（11号峰）作为参照峰，共有峰相对保留时间、相对峰面积结果见表 3和4。
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表 3 共有峰相对峰面积 Table 3 Relative peak areas of common peaks |
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表 4 共有峰相对保留时间 Table 4 Relative peak areas of common peaks |
采用对照品对照和参考文献中的质谱一级、二级数据和色谱保留行为[4, 5, 6]，共确定了11个共有峰代表的化学成分，其中11、17、18号峰采用对照品对照确定为二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚。4、6、9、12、13、14、15、16号峰通过质谱鉴定为没食子酸、儿茶素、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2,3-二-O-β-D-葡萄糖苷、polygonimitin B、大黄素-1-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-(6′-O-丙二酰)-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-(6′-O-丙二酰)-β-D-葡萄糖苷。结果见表 5。
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表 5 共有峰的化学成分推测 Table 5 Speculation of chemical components of common peaks |
经实验得到16批何首乌指纹图谱，见图 1，将16批何首乌药材样品指纹图谱的AIA数据文件导入中药指纹图谱相似度评价系统研究版（2012），进行相似度计算，设置样品S7图谱为参照图谱，对照图谱生成方法采用中位数法，时间窗宽度为0.1，自动匹配，生成对照指纹图谱，见图 2，其相似度结果见表 6。
 | 图 1 16批何首乌指纹图谱Fig.1 HPLC-fingerprint of 16 batches of samples |
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11-二苯乙烯苷 17-大黄素 18-大黄素甲醚 11-2,3,5,4′-tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glucoside 17-emodin 18-physcion 图 2 何首乌对照指纹图谱Fig.2 Reference-fingerprint for 16 batches of samples |
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表 6 16批何首乌相似度计算结果 Table 6 Similarity of 16 batches of samples |
与16批何首乌生成的对照指纹图谱比较，各批的何首乌样品的相似度在0.936～0.998，表明各批何首乌样品的质量相对稳定，从图 1可以看出不同产地何首乌的化学成分基本一致，从共有峰面积RSD可以看出共有峰峰面积差异较大，表明各成分量有所差异。从表 6可以看出，样品S1、S4、S7、S8、S12相似度相对较低，其他样品相似度相对较高，其中样品S8相似度最低。
2.6.5 何首乌样品主成分分析为了更加合理地评价何首乌的品质，对何首乌共有峰峰面积主成分分析，将16批何首乌样品的共有峰面积导入MatlabR2014a中，运用zero-mean normalization处理方法进行数据前处理，然后进行主成分分析，分别对应于3个最大特征值的主成分PC1、PC2、PC3，从方差贡献率来看，PC1贡献率为70.3%，贡献率最大，包含的信息最多；PC2贡献率为15.7%，PC3贡献率为7.7%，前3个主成分的累计贡献率93.7%，所以对前3个主成分分析已经能反映何首乌的基本特征。分别以第1、第2、第3主成分建立坐标系，进行投影，得到16批样品的PCA得分图（图 3），同时对PC1进行载荷图分析（图 4）。用以反映不同样品间差异的主要元素。
 | 图 3 第1、2主成分投影图Fig.3 Projection drawing of PC1 and PC2 |
 | 图 4 第1主成分载荷图Fig.4 Loading diagram of PC1 |
根据图 4可知，对主成分PC1贡献最大的因素是11号峰。从第1、2主成分投影图可以看出除了样品S1、S7、S8、S12、S15、S16、S11、S14之外，其余样品聚集在一块，其中与其他药材的区别主要体现在第1主成分上，其中样品S1、S8、S12、S15、S16在第1主成分的得分上较低，样品S11、S14得分较高，得出结果与“2.5”项中得到的结果基本一致。
从三维得分图（图 5）可以看出样品S8为一类、S1、S7、S12为一类，其他为一类。分析结果和相似度分析结果一致。也进一步验证了所建指纹图谱的可靠性。
 | 图 5 何首乌第1、2、3主成分三维得分图Fig.5 3DDiagram of PC1,PC2,and PC3 scores of samples |
本实验对样品的提取溶剂、提取时间、提取方法进行了考察，最终确定了“2.3”项下供试品溶液的制备方法。同时对检测波长、色谱柱、流动相系统、梯度条件、柱温进行了优选，最终确定了最优的色谱条件[7, 8, 9, 10, 11]。同时本实验在指纹图谱的基础上创新性地采用了HPLC/Q-TOF/MS法对共有峰进行了归属，运用主成分分析、二苯乙烯苷测定对指纹图谱进行验证。
本实验确定了何首乌指纹图谱中的18个共有峰，并对部分共有峰进行定性分析，其中4、6、9、11、12、13、14、15、16、17、18号峰得出分别是没食子酸、儿茶素、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2,3-二-O-β-D-葡萄糖苷、二苯乙烯苷、polygonimitin B、大黄素-1-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-(6′-O-丙二酰)-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-(6′-O-丙二酰)-β-D-葡萄糖苷、大黄素、大黄素甲醚。
何首乌指纹图谱共有峰的保留时间差别较小，但峰面积有较大差异，说明不同批次的同一化学成分的量有所差别。不同批次的何首乌相似度0.936～0.998，表明不同产地的何首乌质量相对稳定，没有太大差异。本实验中峰面积RSD较大，但相似度较高，分析原因可能是二苯乙烯苷峰面积过大，从而导致相似度较高。
主成分分析结果可知，样品S1、S7、S12为一类，S8为一类，其他样品为一类，其分析结果与16批样品相似度结果基本一致，进一步验证了本实验的合理与准确性。对第1主成分进行载荷图分析，可以得出对此主成分贡献最大的峰为11号峰，即为二苯乙烯苷，样品S1、S8、S12、S15、S16在第一主成分的得分较低，样品S11、S14得分较高，与二苯乙烯苷的测定结果一致。同时二苯乙烯苷的量满足《中国药典》要求。
研究表明本实验建立的方法简便、可靠，可为综合评价何首乌质量提供指导和依据。
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