西瓜霜具有清热泻火、消肿止痛的功效^[1]，用于治疗咽喉肿痛、喉痹、口疮，被历代医家视为治疗咽喉、口腔疾病的良药，为“喉科圣药”^[2]。而传统中医认为，西瓜霜有清热泻火、消肿止痛的功能，主要是因为西瓜能清热解暑，芒硝能清热泻火，两药合制，起到协同作用，性味增强，并使芒硝更纯净，增强清热泻火之功^[3]。一直以来，西瓜霜的制备被认为属于中药炮制的制霜法，为西瓜中渗析出的芒硝的细小结晶。而本课题组通过研究发现，西瓜霜制备过程实质可能是以西瓜为培养基的发酵过程，在高盐情况下（含一定量Na₂SO₄·10H₂O）进行的发酵可能为其炮制的真正作用。发酵微生物产生的代谢产物及生物转化产物往往具有抗菌活性，抗菌作用应当是西瓜霜发挥药效作用的重要机制，即发酵微生物的代谢物或生物转化产物发挥抗菌作用应为西瓜霜治疗口腔炎症的机制。据此，本实验对不同发酵时间的西瓜霜进行抗菌活性比较，确定最佳发酵炮制时间；进而对最佳发酵时间得到的西瓜霜进行抗菌活性部位筛选，以确定其抗菌活性有效部位。

福氏痢疾杆菌Shigella flexneri、金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus、白葡萄球菌Staphylococcus albus、柠檬葡萄球菌Staphylococcus citreus、乙型溶血性链球菌β-emolyticstre ptococcus、乙型副伤寒杆菌Bacillus paratyphosus B、大肠杆菌Escherichia coli、绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa，由黑龙江中医药大学微生物免疫教研室提供。

R-3旋转蒸发仪，瑞士BUCHI；PH-71冻干机，德国Christ；电热恒温培养箱，天津泰斯特仪器有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；Ⅱ级B2型生物安全柜，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

牛肉膏、蛋白胨、琼脂，北京奥博星生物技术有限责任公司；NaCl、NaOH、芒硝，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；pH精密试纸，杭州富阳特种纸业有限公司；AB-8大孔树脂，沧州宝恩吸附材料科技有限公司；双黄连片，哈尔滨圣泰制药股份有限公司（批号20120209）；盐酸小檗碱片，东北制药集团沈阳第一制药有限公司（批号20121217）。

新鲜西瓜（产地为黑龙江省双城市乐群乡，品种为帝王花冠），经黑龙江中医药大学药用植物学教研室苏连杰教授鉴定为葫芦科植物西瓜Citrullus lanatus (Thunb.) Matsumu. et Nakai的成熟新鲜果实。

按照文献方法^[3]自制西瓜霜：取新鲜西瓜36.13 kg切碎后放入发酵罐或容器中，加入芒硝5.42 kg（每100千克西瓜加入15 kg芒硝），置于阴凉通风处放置，分别发酵7、15、22、30、50 d，期间定期搅拌，注意通风、溶氧，发酵结束后，离心，取上清液，将上清液冷冻干燥，制得白色结晶粉末。按照《中国药典》2010年版一部中西瓜霜的标准测得Na₂SO₄质量分数为90%，符合药典标准，即得到的白色结晶粉末为西瓜霜。

取发酵15 d的自制西瓜霜，用2倍量的甲醇超声提取，每次30 min，重复提取3次，减压回收甲醇，得西瓜霜甲醇提取物（由于西瓜霜中含有大量的无机盐Na₂SO₄，而其不溶于甲醇溶液中，故用甲醇提取得到的甲醇提取物含有西瓜霜中除Na₂SO₄以外的成分），再将西瓜霜甲醇提取物进行大孔吸附树脂柱色谱，依次分别用水和95%乙醇洗脱，分别得到各自的洗脱物后减压回收溶剂，即得AB-8大孔树脂水洗脱组分和95%乙醇洗脱组分。

牛肉膏蛋白胨液体培养基^[4]：牛肉膏0.3 g、蛋白胨1 g、NaCl 0.5 g，加100 mL蒸馏水，在沸水中加热使之完全溶解；冷至40～45 ℃时，以0.1 mol/L NaOH溶液调pH 7.6，再煮沸10 min，使培养基再次充分溶解，用滤纸滤过，补足失水；重新校正1次pH值。根据需要分装于试管或烧瓶内。放高压灭菌器内103.4 kPa，121 ℃，灭菌15～20 min。培养基的无菌检测：将已灭菌的培养基，置于孵箱中37 ℃培养24 h，如无细菌生长，即可使用。

牛肉膏蛋白胨固体培养基^[5]：按液体培养基配制方法，校正pH值后，加入1.5%的营养琼脂，加热溶解，滤过，装入锥形瓶中，按上法灭菌，并在无菌条件下，分装于无菌表面皿中，放凉，在孵箱中37 ℃培养24 h，如无细菌生长，即可使用。

采用连续稀释法^[6]：将牛肉膏蛋白胨液体培养基溶液分装于10只无菌试管内，第1管l.5 mL，其余各管l mL；另吸取配制的供试药液（西瓜霜粉末、甲醇提取物和洗脱物干膏加适量蒸馏水溶解，再用培养液稀释）0.5 mL加入第1管内，吹吸3次，混匀后吸出l mL至第2管中，混匀后再吸l mL至第3管中，依此类推至第9管时，混匀后吸出l mL弃去，即1～9管含药液稀释比率分别为l∶4、l∶8、l∶16、l∶32、l∶64、l∶128、l∶256、l∶512、l∶1 024，第10管不加药物（空白组）；除每组的第9管外，向各管中加试验菌液0.05 mL，轻轻摇匀；将以上各管于37 ℃，培养24 h并观察结果。肉眼观察判定结果，与空白组对照无细菌生长的最低药物质量浓度即为MIC。考察发酵时间的影响时设芒硝对照组，考察活性部位时设双黄连和盐酸小檗碱为阳性对照。

采用平板画线法^[7]：将上述无细菌生长的各菌药混合液接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置培养箱内37 ℃继续培养24 h，观察生长情况，没有细菌生长的最低质量浓度为MBC。考察发酵时间的影响时设芒硝对照组，考察活性部位时设双黄连和盐酸小檗碱为阳性对照。

在不同发酵时间对西瓜霜抗菌活性的影响实验中，表 1和表 2结果表明，发酵15和22 d的西瓜霜粉末对各种菌株的MIC和MBC均最低，发酵7、30 d西瓜霜的MIC和MBC略高，发酵50 d西瓜霜的MIC和MBC最大。说明不同发酵时间对西瓜霜的抗菌活性具有显著影响，发酵时间以15 d为最佳时间。结果还发现，西瓜霜的抑菌及杀菌效果明显优于芒硝，说明西瓜霜中除了含有来自芒硝的Na₂SO₄主要成分外，尚有其他未知成分具有很强的抑菌和杀菌作用，特别是对乙型溶血性链球菌的抑菌和杀菌作用最强，因此对西瓜霜除Na₂SO₄以外的其他成分进行有效部位筛选。

表 1(Table 1)

表 1 发酵不同时间制得的西瓜霜的抑菌活性 Table 1 MIC of MP with different fermentation time 药物 MIC/(mg·mL-1) 金黄色葡萄球菌 柠檬葡萄 球菌 白葡萄球菌 绿脓杆菌 乙型副伤寒杆菌 乙型溶血性链球菌 福氏痢疾杆菌 大肠杆菌 西瓜霜粉末 发酵7 d 31.3 31.3 31.3 62.5 31.3 15.6 31.3 31.3 西瓜霜粉末 发酵15 d 31.3 31.3 31.3 31.3 31.3 7.8 31.3 31.3 西瓜霜粉末 发酵22 d 31.3 31.3 31.3 31.3 31.3 31.3 31.3 31.3 西瓜霜粉末 发酵30 d 31.3 31.3 31.3 31.3 31.3 31.3 31.3 31.3 西瓜霜粉末 发酵50 d 62.5 62.5 31.3 62.5 62.5 31.3 62.5 62.5 芒硝 250.0 250.0 125.0 250.0 250.0 125.0 250.0 125.0

表 1 发酵不同时间制得的西瓜霜的抑菌活性 Table 1MIC of MP with different fermentation time

表 2(Table 2)

表 2 发酵不同时间制得的西瓜霜的杀菌活性 Table 2 MBC of MP with different fermentation time 药物 MBC/(mg·mL-1) 金黄色葡萄球菌 柠檬葡萄球菌 白葡萄球菌 绿脓杆菌 乙型副伤寒杆菌 乙型溶血性链球菌 福氏痢疾杆菌 大肠杆菌 西瓜霜粉末 发酵7 d 62.5 31.3 31.3 62.5 31.3 15.6 31.3 — 西瓜霜粉末 发酵15 d 31.3 31.3 31.3 62.5 31.3 15.6 31.3 — 西瓜霜粉末 发酵22 d 31.3 31.3 31.3 62.5 31.3 31.3 31.3 31.3 西瓜霜粉末 发酵30 d 62.5 31.3 31.3 125.0 31.3 31.3 31.3 31.3 西瓜霜粉末 发酵50 d 125.0 62.5 62.5 125.0 62.5 31.3 125.0 — 芒硝 250.0 250.0 — 250.0 — — —

表 2 发酵不同时间制得的西瓜霜的杀菌活性 Table 2MBC of MP with different fermentation time

经过15 d发酵制得的西瓜霜的不同提取部位对受试菌种的MIC和MBC值见表 3和表 4。可以看出西瓜霜甲醇提取物的MIC和MBC较西瓜霜粉末小很多，表明经甲醇超声提取除盐后，抗菌活性物质主要存在于甲醇提取物中。经大孔树脂分离后，发现95%乙醇洗脱组分的抑菌作用最强，说明西瓜霜抗菌活性物质主要存在于95%乙醇洗脱组分中，因此初步确定西瓜霜抗菌有效部位为甲醇提取物的95%乙醇洗脱组分。

表 3(Table 3)

表 3 发酵15 d制得的西瓜霜不同提取部位的抑菌活性 Table 3 MICof different parts from MeOH extract of MP with 15 d fermentation 药物 MIC/(mg·mL-1) 金黄色葡萄球菌 柠檬葡萄 球菌 白葡萄 球菌 绿脓杆菌 乙型副伤寒杆菌 乙型溶血性链球菌 福氏痢疾杆菌 大肠杆菌 西瓜霜粉末 31.3 31.3 31.3 31.3 31.3 7.8 31.3 31.3 甲醇提取物 12.5 12.5 12.5 12.5 12.5 2.1 12.5 12.5 水洗脱组分 72.5 72.5 72.5 72.5 72.5 18.1 72.5 72.5 95%乙醇洗脱组分 1.9 1.9 1.9 1.9 1.9 1.9 1.9 1.9 双黄连片 5.2 10.4 20.8 5.2 10.4 10.4 10.4 5.2 盐酸小檗碱片 0.063 0.063 0.126 0.063 0.252 0.063 0.063 0.063

表 3 发酵15 d制得的西瓜霜不同提取部位的抑菌活性 Table 3MICof different parts from MeOH extract of MP with 15 d fermentation

表 4(Table 4)

表 4 发酵15 d制得的西瓜霜不同提取部位的杀菌活性 Table 4 MBC of different parts from MeOH extract of MP with 15 d fermentation 药物 MBC/(mg·mL-1) 金黄色葡萄球菌 柠檬葡萄 球菌 白葡萄球菌 绿脓杆菌 乙型副伤寒杆菌 乙型溶血性链球菌 福氏痢疾杆菌 大肠杆菌 西瓜霜粉末 31.3 31.3 31.3 62.5 31.3 15.6 31.3 — 甲醇提取物 12.5 12.5 12.5 12.5 12.5 2.1 12.5 12.5 水洗脱组分 72.5 72.5 72.5 72.5 72.5 18.1 72.5 72.5 95%乙醇洗脱组分 1.9 1.9 1.9 1.9 1.9 1.9 1.9 1.9 双黄连片 10.4 10.4 20.8 10.4 10.4 20.8 10.4 10.4 盐酸小檗碱片 0.126 0.126 0.126 0.252 0.504 0.126 0.126 0.126

表 4 发酵15 d制得的西瓜霜不同提取部位的杀菌活性 Table 4MBC of different parts from MeOH extract of MP with 15 d fermentation

微生物的特性是分泌抗菌物质，抑制其他微生物的生长，而人们正是利用微生物这样的特性发现很多具有药用价值的抗菌成分，对西瓜霜的抗菌活性有效部位的筛选实验初步表明以西瓜为培养基发酵产生的代谢物具有抗菌作用，可能是西瓜霜发挥清热泻火、消肿止痛作用的重要物质基础。

微生物在生命活动中，可从初级代谢产物出发，合成一些生理功能不够明确、化学结构特殊、与维持生命活动无关并且不影响生命活动的代谢产物，即次级代谢产物（secondary metabolism）。次级代谢产物的种类比较多，结构复杂，合成所需的前体物质较多，代谢调节环节也相对比较复杂，中药发酵是在一种特定的条件下进行的，中药作为培养基，其中往往含有多种化学成分，这些成分通常也具有抑菌活性。在此条件下可能实现菌种的自然选育，本实验首次基于微生物次生代谢产物生成及生物转化理论研究发酵中药^[8]，即将微生物免疫学和生物技术等与现代中药化学结合，西瓜霜发酵中可能由微生物产生新的次生代谢产物或生物转化产物，对于常见致病菌，尤其是口腔、上呼吸道致病菌产生抑制作用，从而治疗咽喉肿痛、喉痹、口疮等疾病。

本研究初步探讨了西瓜霜发酵的最佳时间，以及以最佳时间发酵得到的西瓜霜的有效部位，为阐释西瓜霜的作用机制奠定了基础，同时对寻找治疗上呼吸道疾病的新抗菌物质提供了新的思路。