灵芝Ganoderma lucidum (Lesyss ex Fr.) Karst属真菌门担子菌亚门多孔菌目灵芝菌科灵芝属真菌，素有“仙草”之美誉，在我国已有悠久的药用历史。自20世纪50年代以来，灵芝子实体已实现了人工栽培，随着灵芝菌丝体深层发酵培养技术的发展，灵芝的研究和开发日益广泛。灵芝化学成分比较丰富，含有多糖、三萜、有机酸、可溶性蛋白质、氨基酸、生物碱、多肽、腺嘌呤、腺苷、尿嘧啶、尿苷及D-甘露糖等。三萜酸是灵芝体内次生代谢产物，同时也是其主要活性成分之一，具有广泛药理活性，日益引起人们的重视。为了对灵芝三萜类化合物开展进一步的研究，本文对灵芝三萜类化合物研究进展进行简要概述。

1 灵芝三萜的种类

20世纪80年代，灵芝脂溶性成分的研究广泛而深入，1982年首次从灵芝子实体干燥的表皮中分离出2个新的三萜类化合物灵芝酸A和灵芝酸B，到1999年，被发现的三萜类化合物达119种，根据结构特征可将这些三萜分为10组。目前为止有两百多种三萜类化合物从灵芝属真菌子实体、孢子粉、菌丝和培养基中被分离得到并进行了化学结构鉴定，这些三萜类多数为高度氧化的羊毛甾烷型化合物。

灵芝三萜类化合物相对分子质量一般为4×10⁵～6×10⁵，结构较为复杂，目前已知有7类母核和14种侧链类型，母核上有多个不同取代基：羧基、羟基、酮基、甲基、甲氧基、乙酰基等。灵芝三萜类根据碳原子数可分为C₃₀、C₂₇和C₂₄ 3种；依据所联接官能团和侧链结构不同，可分为灵芝酸类、醇类、醛类、内酯类等几大类^[1]。

2 灵芝三萜药理作用

灵芝三萜具有广泛药理活性，如抗肿瘤、保肝排毒、抗HIV病毒、降低胆固醇等。

2.1 抗肿瘤作用

Kao等^[2]对灵芝的抗肿瘤活性进行了研究，灵芝三萜抗肿瘤作用机制与多糖有差别，灵芝多糖抑制肿瘤是通过增强宿主免疫应答间接发挥作用，三萜一般被认为是直接对癌细胞发挥细胞毒作用^[3]。多数研究表明灵芝三萜抑制肿瘤细胞增殖与阻抑细胞周期和诱导细胞凋亡相关^{[4, 5]}。还有研究表明，灵芝三萜抑制肿瘤细胞增殖和转移的活性与其能抑制肿瘤细胞血管再生有关^{[6, 7]}。灵芝三萜类化合物复杂多样，不同三萜化合物对肿瘤细胞作用不同。唐庆九等^[8]从灵芝子实体中分离纯化得到的中性三萜类化合物对多种肿瘤细胞株如小鼠淋巴癌L1210、人淋巴癌K562、人肠癌SW620、人乳腺癌MCF7有抑制活性，且可诱导人肠癌SW620细胞凋亡；酸性三萜类化合物在抑制肝癌和宫颈癌中作用明显，如赤芝酸A、N和灵芝酸E能抑制人肝癌细胞HepG₂增殖，灵芝酸F、K、B、< span lang="EN-US" xml:lang="EN-US">D能抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖^[9]，灵芝酸Mf、S诱导线粒体介导的人宫颈癌HeLa细胞凋亡^[10]。酸性三萜类化合物对K562抑制率较低。

2.2 保肝作用

陈洁等^[11]研究灵芝三萜对肝纤维化的保护作用，灵芝三萜治疗组能够显著降低大鼠血清中丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）以及肝组织中转化生长因子-β1（TGF-β1）mRNA、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的表达，病理切片显示灵芝三萜能够显著减轻大鼠肝纤维化的程度。王明宇等^[12]从灵芝子实体中分离到灵芝三萜（GT，主要含灵芝酸A）。实验表明，GT对四氯化碳、氨基半乳糖苷和卡介苗＋脂多糖所致的3 种肝损伤模型小鼠有较好的保肝作用，可明显降低模型动物的血清ALT和肝脏三酰甘油（TG）的量，并不同程度减轻动物肝损伤，与阳性对照药马洛替酯（malotilate）作用相似。李鹏等^[13]研究发现灵芝三萜酸对小鼠急性肝损伤有保护作用。

2.3 抗HIV-1和HIV-1蛋白酶活性

彭珍华等^[14]对灵芝三萜类化合物抗HIV的各种机制，及三萜结构及活性进行了总结，指出灵芝三萜类化合物抗HIV活性主要是通过抑制HIV吸附或膜的融合、抑制HIV-1反转录酶、抑制HIV-1蛋白酶、抑制病毒成熟等途径。灵芝三萜化合物灵芝酸A、灵芝酸 B、lucidumol B、ganodermanondiol、ganodermanontriol有显著抑制HIV-1蛋白酶活性，IC₅₀为20～90 μmol/L^[15]。这一研究结果为寻找和研发新型抗HIV药物提供有益的启示。

2.4 免疫促进作用

研究发现灵芝酸能促进带Lewis肺癌的Guinea猪体内白细胞介素-2（IL-2）的量升高，并提高NK细胞的免疫活性，具有免疫促进功能，灵芝三萜提取物能有效促进脾细胞产生IL，增加抗体细胞的产生，促进免疫细胞增殖^[16]。

2.5 调血脂和降血糖作用

衣艳君等^[17]研究灵芝对大鼠血脂水平的影响时发现，灵芝三萜可有效降低血清中TG、胆固醇、低密度脂蛋白的量，具有明显的调血脂作用。从灵芝中分离出的灵芝酸B、C在C-7,15连有氧基，许多加氧的甾醇可抑制动物细胞中的甾醇合成。灵芝酸B和灵芝酸B、C的衍生物对由羊毛甾醇或24,25-二羟基羊毛甾醇生物合成胆固醇有抑制作用。另外灵芝三萜类也有降低血糖的作用。研究证实灵芝三萜类物质中的灵芝酸Z和灵芝酸S可以抑制3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶的活性。

2.6 其他

另外，灵芝三萜类化合物还有抗真菌、抗炎、益智和延缓衰老等作用^[18]。

3 灵芝三萜生物合成途径

三萜类化合物属于类异戊二烯，是自然界一大类物质的总称。所有类异戊二烯，都有共同的前体异戊二烯焦磷酸（IPP）。灵芝三萜的合成是通过类异戊二烯合成途径进行的，即由乙酰CoA通过经典的甲羟戊酸途径，合成IPP和二甲基烯丙基焦磷酸，以此为底物，经过法尼基焦磷酸、鲨烯、鲨烯-2,3-氧化物和羊毛甾醇等中间体，最后经过一系列氧化、环化反应形成。

随着研究的深入，近年来多个编码灵芝三萜生物合成途径关键酶的基因被克隆和鉴定：催化法尼基焦磷酸转化为鲨烯的鲨烯合酶基因（SQS）^[19]，催化羟甲基戊二酰辅酶A生成的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因（HMGS）^[20]，催化羟甲基戊二酰辅酶A转化为甲羟戊酸的3-羟基-3-甲基戊二酰乙酰辅酶A还原酶基因（HMGR）^[21]，催化异戊烯基焦磷酸生成的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因（MVD）^[22]，催化法尼基焦磷酸生成的法尼基焦磷酸合酶基因（FPS）^[23]，催化羊毛甾醇合成的羊毛甾醇合酶基因（LS）^[24]。异戊二烯焦磷酸异构酶是催化IPP和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）之间的可逆反应的重要酶，目前已被克隆^[19]。羊毛甾醇是灵芝三萜的骨架，经历一系列氧化、还原、酰基化反应形成种类繁多的三萜，其间的反应途径尚不清楚，近期有研究者提出细胞色素P450（CYP450）超家族的氧化催化功能在修饰羊毛甾醇骨架中有重要作用^[25]。

4 影响灵芝三萜类积累的因素

三萜是灵芝体内次生代谢产物，次生代谢产物的产生和积累受到自身遗传和环境因素的调控^[26]，灵芝体内三萜的种类和量因不同发育时期、栽培环境、培养方式等而有所差异。

4.1 生长时期对灵芝三萜的影响

灵芝从菌丝体到子实体的生长发育过程，其形态及生理生化、代谢等方面都发生了重大的转变，灵芝三萜的代谢受发育进程的调控。付立忠等^[27]检测了灵芝子实体不同生长发育期多糖和总三萜量变化情况，发现子实体总三萜量在现蕾期、芝盖形成期和成熟期较高，衰老期显著降低，这一结论与宝萍萍等^[28]的一致。徐江^[29]通过HPLC分析灵芝不同发育阶段三萜酸组成和量，发现从菌丝体到原基期的转变过程中，三萜酸量显著升高，且用Real-time PCR分析了197个CYP基因的表达，78个CYP基因表达上调，表达模式与LS的表达高度相关，与三萜化合物的量呈正相关。Ren等^[30]分析了灵芝菌丝、原基和子实体发育时期10个基因的转录水平，也发现基因的差异表达与灵芝三萜酸量有直接的关系。余素萍等^[31]用HPLC法分析灵芝菌丝体发酵过程中三萜类成分变化情况，发现三萜类成分在菌丝发酵后期才大量产生，菌丝中三萜的种类与子实体相比相对较少。这些现象均说明灵芝三萜种类和量随自身生长发育发生改变，生物合成途径相关酶基因的表达是其内部调控的一个重要因素。

4.2 培养条件对灵芝三萜的影响

Mayasaki等^[32]提出灵芝三萜的种类和量与其生长状态有关，认为野生灵芝子实体三萜的种类及量较高，人工栽培次之，发酵菌丝体较少。但是莫峥嵘等^[33]通过比较几种不同来源的灵芝发现栽培海南赤芝的总三萜酸量高于野生海南赤芝及栽培信州赤芝。说明灵芝子实体三萜的量与其特定的生长环境有一定关系，不能一概而论。Fang等^[34]提出2步法即先摇床培养后静置培养方式有利于提高菌丝体生物量及总三萜的量。Xu等^[35]比较了摇床培养和静置培养灵芝菌丝产三萜酸的情况，发现传统的液体振荡培养方式下总灵芝酸的量基本保持不变，静置培养的量为前者的2～3倍，培养第10天达到最高，并分析了4种单体三萜酸的变化规律。在培养基配方等培养条件方面，Tang等^[36]比较了蔗糖、麦芽糖、乳糖和葡萄糖4种碳源对灵芝发酵过程中产灵芝多糖和灵芝三萜酸的影响，Xu等^[37]对多种碳源和氮源进行比较，筛选出了提高菌丝生物量和三萜酸量的组合。Fang等^[38]研究发现初始pH值在3.5～7.0对菌丝的生长和代谢产物的生物合成有很大的影响。李娜等^[39]采用4因素3水平正交设计法研究液体培养条件下各因子（碳源、氮源、无机盐、pH）对灵芝三萜产量的影响及因子间的相互作用，结果表明碳源作用最大。王立华等^[40]研究了光质对PDA培养基培养的灵芝菌丝体的影响，发现蓝光利于菌丝体生长及多糖积累，不同光质处理灵芝菌丝体总三萜积累及其组分差异有待进一步研究。余志坚等^[41]研究了5种中药水提液对灵芝菌丝体生物量及三萜量的影响，发现中药水提液对菌丝生物量均有促进作用，其中银杏水提液对灵芝菌丝体生物量和三萜量的促进作用均最明显。

4.3 诱发因子对灵芝三萜生物合成途径的调控

在某些因子诱导下关键基因的表达上调可以提高灵芝三萜的量，近年来国内外研究者采用一些诱导剂对灵芝三萜生物合成进行诱导。高兴喜等^[42]采用3种食用菌病原真菌为激发子考察真菌激发子对灵芝生物量及活性成分积累的影响，发现3种真菌激发子对灵芝生物量的积累都产生了积极的影响，顶头孢激发子对灵芝多糖和灵芝三萜积累的诱导作用最好，木素木霉激发子诱导作用次之，蘑菇轮枝孢激发子作用最弱。真菌激发子对微生物体内特定次生代谢产物的影响及其作用机制还有待深入研究。

茉莉酸甲酯（MeJA）能够显著诱导灵芝总三萜量的增加及三萜生物合成途径中已知基因转录水平的提高。Ren等^[43]使用MeJA对液体摇瓶培养的灵芝菌丝进行诱导，发现诱导后的灵芝三萜酸产量比对照高45.3%，并使用定量Real-time PCR测定灵芝三萜酸生物合成途径多个基因的转录水平，包括HMGS、HMGR、MVD、FPS、SQS及LS。结果发现MeJA诱导后，这些基因表达水平上调，但不同浓度MeJA对各基因表达水平影响不同，且同一浓度MeJA在不同培养时间诱导基因转录水平变化也不一致，在促进灵芝酸高产的最佳MeJA浓度处理下也不是所有的基因都表现出最高转录水平。表明各基因对灵芝三萜酸生物合成有不同的影响。Shi等^[23]发现在灵芝FPS基因5’端序列有2个潜在的MeJA响应元件，说明FPS可能通过MeJA响应元件与茉莉酸的相互作用，参与三萜酸合成途径的MeJA信号转导。Liang等^[44]使用phenobarbital（一种P450诱导剂）对液体静置培养的灵芝进行诱导，结果发现振荡培养后再静置培养，施以100 μmol/L的phenobarbital可促进灵芝总三萜酸高产，中间产物羊毛甾醇积累量下降，同时三萜酸生物合成途径3个关键酶HMGR、SQS及LS基因转录水平上调。

5 展望

灵芝三萜类化合物生物合成下游途径尚不明确，有研究者提出了可能参与羊毛甾醇修饰的基因家族，可对这些候选基因过表达、沉默或敲除，或者施以化学试剂或光等诱导因素，并结合特定的三萜类产物，逐步揭示下游合成途径关键基因。由于三萜类化合物种类繁多，分离纯化较困难，目前有许多研究者对灵芝醇提物进行药理活性筛选，但多数药理研究停留于细胞活性筛选的体外试验，动物药理实验有待进一步深入研究，期待发现灵芝三萜化合物新的药理作用，以便开发灵芝新用途。