虎杖Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix为蓼科（Polygonaceae）植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. 的干燥根及根茎，主要化学成分为蒽醌及蒽醌苷、二苯乙烯类、黄酮类及酚性成分等，具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化及调节代谢等作用^{[1, 2]}。已有虎杖药材指纹图谱研究报道^{[3, 4, 5, 6, 7]}，但采用高效液相色谱法-二极管阵列检测器-蒸发光检测器（HPLC-DAD-ELSD）联用技术进行虎杖药材指纹图谱的研究尚未见报道。HPLC-DAD-ELSD联用技术弥补了HPLC-DAD只能检测到对紫外有吸收的化合物的缺点，同时补充了对药材中各化学成分量的宏观了解。本实验研究了10批虎杖药材的HPLC-DAD-ELSD指纹图谱，相似度均大于0.90，表明建立的指纹图谱方法准确、稳定、重复性好，为虎杖药材的质量控制提供了科学依据。

LC-20A高效液相色谱仪，SPD-M20A二极管阵列检测器，SIL-10AF自动进样器，LC-15C二元梯度泵，LC-solution色谱工作站（日本岛津公司），蒸发光散射检测器（Alltech ELSD2000），XWK-III空气泵（天津市华生分析仪器厂），AK-400A粉碎机（温岭市奥力中药机械有限公司），BT-25S天平（德国赛多利斯），HH-4数显恒温水浴锅（常州中捷实验仪器制造有限公司）。

大黄素对照品（批号 D-029-140728-1）购自成都瑞芬思生物科技有限公司，大黄素甲醚（批号 D-004-140728-1）、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批号 D-055-140728）、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷（批号 D-056-140728），虎杖苷（批号 H-012-140729），白藜芦醇（B-002-140727）均购自成都瑞芬思生物科技有限公司，质量分数均大于98%，纯净水为超纯水，乙腈为色谱纯，其余均为分析纯。

10批虎杖药材产地依次为四川、山东、安徽、湖北、陕西、贵州、福建、云南、河南、江西，依次编号为S1～S10，由吉林省中医药科学院牛志多研究员鉴定为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sied. et Zucc. 的干燥根茎。

Luna C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-水（B），梯度洗脱，0～8 min，13%～23% A，8～14 min，23% A，14～34 min，23%～50% A，34～46 min，50%～80% A，46～51 min，80%～13% A，51～56 min，13% A。体积流量1 mL/min，柱温35 ℃，进样量10 μL，检测波长254 nm，蒸发光检测器漂移管温度为109 ℃，载气体积流量3.0 L/min。

分别称取虎杖苷、白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷及大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷适量，甲醇溶解，配制成质量浓度分别为20.2、19.4、3.2、29.2、43.6、55.5 μg/mL。

精密称定虎杖药材粉末（过60目）1.0 g，置于50 mL圆底烧瓶中，70%乙醇30 mL，称质量，加热回流提取0.5 h，冷却至室温，补足减失的质量，用0.45 μm微孔滤膜滤过，续滤液备用。

取S3药材供试品溶液，连续进样5次，进样量为10 μL，统计并计算所得谱图的相似度及RSD。结果表明，HPLC-DAD指纹图谱的相似度均大于0.99，相似度RSD小于0.33%；HPLC-ELSD指纹图谱的相似度均大于0.99，相似度的RSD均小于0.26%。

取S3药材按供试品溶液方法制备，室温放置，分别于0、2、4、6、12、24 h进样，进样量为10 μL，统计并计算所得谱图的相似度及RSD。结果表明，HPLC-DAD指纹图谱的相似度均大于0.98，相似度RSD小于1.5%；HPLC-ELSD指纹图谱的相似度均大于0.98，相似度的RSD小于0.83%，表明仪器精密度良好。

取S3药材粉末5份，按供试品溶液方法制备，按上述条件测定，统计并计算所得谱图的相似度及RSD。结果表明，6份样品的HPLC-DAD指纹图谱相似度大于0.98，相似度RSD小于1.0%；6份样品的HPLC-ELSD指纹图谱的相似度均大于0.98，相似度的RSD小于0.04%，证明此方法重复性良好。

运用中药指纹图谱相似度软件（2004A版）对10批不同产地的虎杖药材指纹图谱数据进行处理，以S3样品为参照谱图，时间窗宽度为0.50，采用多点校正的方法生成指纹图谱。为保证不同批次虎杖药材指纹图谱匹配时校正时间的准确性，选择了主要色谱峰作为校正的Mark峰。10批药材的HPLC-DAD指纹图谱见图 1。采用中位数法生成10批不同产地虎杖药材的对照谱图（图 2），建立HPLC-DAD指纹图谱的共有模式。

6-虎杖苷 13-白藜芦醇 15-大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷 16-大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷 18-大黄素 19-大黄素甲醚 6-polydatin 13-resveratrol 15-emodin-8-O-β-D-glucoside 16-physcion-8-O-β-D-glucoside 18-emodin 19-physcion 图 1 10批虎杖药材的HPLC-DAD指纹图谱Fig.1 HPLC-DAD fingerprint of 10 batches of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix

图 2 10批虎杖药材的HPLC-DAD指纹图谱的对照图谱Fig.2 HPLC-DAD control fingerprint of 10 batches of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix

10批虎杖药材经HPLC-DAD分离得到70多个色谱峰，比较所测定的色谱图，获得19个共有峰。共有峰经与对照品比对，保留时间和紫外吸收光谱均与对照品一致，18号共有峰（大黄素）峰面积超过总峰面积的10%，且结构稳定，因此选大黄素作为参比峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积（表 1和表 2）。测得S1～S10 10批虎杖药材与共有模式间的相似度依次为0.958、0.971、0.993、0.983、0.980、0.945、0.979、0.950、0.938、0.956，相似度均大于0.90，表明10批不同产地的药材具有良好的相关性。

表 1(Table 1)

表 1 10批药材HPLC-DAD指纹图谱共有峰相对保留时间 Table 1 alloys 峰号 共有峰相对保留时间 RSD/% S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 1 0.075 0.075 0.075 0.075 0.074 0.073 0.075 0.075 0.075 0.075 0.900 2 0.234 0.234 0.237 0.236 0.232 0.231 0.235 0.236 0.238 0.235 0.915 3 0.254 0.254 0.257 0.255 0.251 0.250 0.254 0.256 0.258 0.256 0.983 4 0.284 0.284 0.286 0.285 0.281 0.280 0.284 0.286 0.287 0.285 0.775 5 0.312 0.312 0.315 0.313 0.308 0.307 0.312 0.314 0.315 0.313 0.861 6 0.348 0.348 0.351 0.349 0.345 0.344 0.348 0.349 0.351 0.350 0.664 7 0.363 0.363 0.366 0.363 0.357 0.356 0.362 0.364 0.366 0.364 0.932 8 0.403 0.403 0.406 0.403 0.395 0.393 0.401 0.404 0.406 0.404 1.093 9 0.419 0.419 0.422 0.419 0.411 0.410 0.417 0.420 0.423 0.419 1.018 10 0.455 0.455 0.458 0.454 0.444 0.442 0.452 0.455 0.459 0.455 1.233 11 0.510 0.510 0.512 0.511 0.504 0.472 0.510 0.511 0.515 0.511 2.457 12 0.531 0.531 0.525 0.525 0.522 0.520 0.524 0.529 0.529 0.525 0.714 13 0.605 0.605 0.610 0.606 0.599 0.597 0.604 0.606 0.610 0.607 0.690 14 0.655 0.654 0.655 0.656 0.654 0.654 0.656 0.655 0.659 0.655 0.228 15 0.676 0.684 0.668 0.669 0.667 0.666 0.668 0.672 0.671 0.668 0.812 16 0.742 0.740 0.742 0.743 0.743 0.742 0.743 0.742 0.743 0.743 0.128 17 0.908 0.907 0.911 0.910 0.907 0.907 0.909 0.909 0.911 0.910 0.178 18 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000 19 1.108 1.108 1.112 1.111 1.109 1.109 1.110 1.108 1.112 1.111 0.146

表 1 10批药材HPLC-DAD指纹图谱共有峰相对保留时间 Table 1Relative retention time of common peaks of HPLC-DAD fingerprint from 10 batches of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix

表 2(Table 2)

表 2 10批药材HPLC-DAD指纹图谱共有峰相对峰面积 Table 2 Relative areas of common peaks of HPLC-DAD fingerprint from 10 batches of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix 峰号 共有峰相对峰面积 RSD/% S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 1 0.046 0.023 0.028 0.036 0.011 0.013 0.025 0.040 0.058 0.021 49.338 2 0.022 0.010 0.011 0.026 0.018 0.009 0.006 0.021 0.027 0.012 46.540 3 0.035 0.024 0.016 0.020 0.019 0.010 0.014 0.039 0.029 0.010 46.563 4 0.053 0.039 0.040 0.060 0.044 0.031 0.027 0.057 0.056 0.023 30.813 5 0.062 0.021 0.022 0.023 0.035 0.014 0.016 0.029 0.032 0.018 51.494 6 0.695 0.371 0.049 0.057 0.441 0.292 0.282 0.634 0.752 0.170 67.877 7 0.168 0.076 0.101 0.116 0.104 0.065 0.067 0.171 0.155 0.053 40.963 8 0.030 0.014 0.030 0.025 0.024 0.012 0.019 0.027 0.043 0.018 37.662 9 0.093 0.046 0.067 0.032 0.004 0.034 0.030 0.057 0.075 0.010 63.369 10 0.141 0.082 0.127 0.101 0.109 0.067 0.062 0.098 0.168 0.024 42.675 11 0.044 0.021 0.003 0.043 0.031 0.015 0.020 0.040 0.073 0.013 67.261 12 0.057 0.361 0.194 0.266 0.278 0.105 0.166 0.534 0.477 0.140 61.401 13 0.150 0.136 0.191 0.090 0.146 0.129 0.101 0.165 0.124 0.093 24.420 14 0.265 0,206 0.126 0.245 0.195 0.106 0.114 0.304 0.369 0.080 47.427 15 1.453 0.985 0.886 1.169 0.991 0.524 0.596 1.552 1.880 0.510 43.868 16 0.172 0.169 0.127 0.170 0.191 0.115 0.102 0.225 0.216 0.087 30.237 17 0.029 0.057 0.037 0.084 0.035 0.023 0.034 0.041 0.063 0.021 46.765 18 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000 19 0.268 0.174 0.097 0.205 0.107 0.087 0.105 0.306 0.277 0.130 47.452

表 2 10批药材HPLC-DAD指纹图谱共有峰相对峰面积 Table 2Relative areas of common peaks of HPLC-DAD fingerprint from 10 batches of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix

虎杖药材HPLC-ELSD指纹图谱软件处理技术参数与HPLC-DAD指纹图谱一致，10批药材的HPLC-ELSD指纹图谱见图 3。采用中位数法生成10批不同产地虎杖药材的对照谱图见图 4，建立HPLC-ELSD指纹图谱的共有模式。

7-虎杖苷 10-白藜芦醇 12-大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷 13-大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷 14-大黄素 7-polydatin 10-resveratrol 12-emodin-8-O-β-D-glucoside 13-physcion-8-O-β-D-glucoside 14-emodin 图 3 10批虎杖药材的HPLC-ELSD指纹图谱Fig.3 HPLC-ELSD fingerprint of 10 batches of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix

图 4 10批虎杖药材的HPLC-ELSD指纹图谱的对照图谱Fig.4 HPLC-ELSD control fingerprint of 10 batches of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix

10批虎杖药材经HPLC-ELSD分离得到40多个色谱峰，比较所测定的色谱图，获得14个共有峰，峰面积占总峰面积90.372%～99.206%，能够代表10批药材HPLC-ELSD指纹图谱的主要特征。共有峰经与对照品比对，保留时间与紫外吸收光谱均与对照品一致。10批药材中二苯乙烯类峰面积占总峰面积约22%，蒽醌类峰面积占总峰面积约28%。大黄素峰面积超过总峰面积的10%，，且结构稳定。因此选作参比峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积（表 3、表 4）。测得10批虎杖药材与共有模式间的相似度依次为0.905、0.958、0.995、0.997、0.999、0.976、0.996、0.977、0.993、0.968，相似度均大于0.90，表明10批不同产地的药材具有良好的相关性。此外，14个共有峰中未包涵大黄素甲醚，原因为产地为S3、S5、S6的药材中大黄素甲醚积分面积过小（小于10 000），在其余7个产地药材中其积分面积适中（大于10 000），且峰面积比例范围为0.039%～0.106%。

表 3(Table 3)

表 3 10批药材HPLC-ELSD指纹图谱共有峰相对保留时间 Table 3 Relative retention time of common peaks of HPLC-ELSD fingerprint from 10 batches of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix 峰号 共有峰相对保留时间 RSD/% S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 1 0.062 0.063 0.062 0.060 0.060 0.060 0.061 0.060 0.060 0.061 1.804 2 0.079 0.079 0.079 0.079 0.079 0.079 0.079 0.079 0.079 0.079 0.000 3 0.211 0.211 0.215 0.212 0.207 0.206 0.211 0.213 0.215 0.213 1.417 4 0.258 0.258 0.261 0.259 0.255 0.253 0.258 0.260 0.261 0.259 0.981 5 0.292 0.292 0.295 0.292 0.287 0.284 0.291 0.293 0.294 0.293 1.146 6 0.340 0.340 0.342 0.339 0.344 0.332 0.338 0.340 0.341 0.340 0.922 7 0.349 0.349 0.352 0.350 0.346 0.346 0.350 0.351 0.353 0.352 0.684 8 0.366 0.365 0.369 0.336 0.360 0.359 0.365 0.367 0.368 0.367 2.670 9 0.532 0.533 0.527 0.527 0.524 0.523 0.526 0.531 0.531 0.527 0.653 10 0.606 0.606 0.612 0.608 0.600 0.599 0.606 0.608 0.611 0.609 0.696 11 0.656 0.656 0.657 0.657 0.656 0.656 0.657 0.656 0.660 0.657 0.198 12 0.677 0.685 0.669 0.669 0.668 0.668 0.670 0.673 0.671 0.670 0.791 13 0.743 0.741 0.743 0.744 0.744 0.744 0.745 0.743 0.744 0.744 0.139 14 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000

表 3 10批药材HPLC-ELSD指纹图谱共有峰相对保留时间 Table 3Relative retention time of common peaks of HPLC-ELSD fingerprint from 10 batches of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix

表 4(Table 4)

表 4 锰合金粉的粒度分类 Table 4 alloys 峰号 共有峰相对峰面积 RSD/% S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 1 2.445 1.512 2.850 3.666 3.188 3.410 2.744 4.040 5.680 2.972 33.84 2 0.078 0.018 0.036 0.070 0.095 0.098 0.053 0.069 0.070 0.064 37.69 3 0.012 0.006 0.005 0.018 0.005 0.004 0.005 0.014 0.012 0.005 57.54 4 0.038 0.022 0.018 0.024 0.014 0.005 0.011 0.035 0.030 0.006 57.12 5 0.119 0.057 0.070 0.065 0.091 0.037 0.032 0.096 0.070 0.029 44.23 6 0.181 0.082 0.092 0.111 0.098 0.030 0.060 0.133 0.116 0.023 51.29 7 0.219 1.469 1.673 2.152 1.599 1.249 1.334 2.267 3.080 0.746 50.80 8 0.224 0.105 0.102 0.119 0.111 0.046 0.067 0.179 0.122 0.039 50.99 9 0.205 0.108 0.088 0.101 0.118 0.021 0.064 0.135 0.193 0.042 55.27 10 0.131 0.156 0.353 0.085 0.252 0.182 0.148 0.189 0.095 0.113 47.52 11 0.102 0.075 0.052 0.116 0.085 0.029 0.043 0.094 0.169 0.025 56.16 12 2.042 1.282 1.359 1.698 1.412 0.644 0.960 1.930 2.799 0.705 44.58 13 0.067 0.071 0.068 0.092 0.081 0.032 0.052 0.079 0.112 0.036 35.43 14 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.00

表 4 10批药材HPLC-ELSD指纹图谱共有峰相对峰面积 Table 4Relative areas of common peaks of HPLC-ELSD fingerprint from 10 batches of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix

分别对超声、回流2种提取方法；甲醇及50%、70%、90%乙醇4种不同溶剂；0.5、1、2 h 3种提取时间进行考察，表明70%乙醇回流提取效率高，提取完全，3种提取时间无显著性差异，故选择提取0.5 h。

同一供试品溶液分别在254、286、306、430 nm检测波长下各色谱峰的色谱分离结果表明，254 nm波长下色谱峰数量较多（52个），分布均匀，各色谱峰均能达到基线分离，峰形对称；286 nm波长下色谱峰数量较少（47个），10、31号色谱峰出现明显拖尾现象；306 nm是二苯乙烯类化合物的最适波长，虎杖苷与白藜芦醇色谱峰分离效果佳，色谱峰峰数量少（29个），11、16号色谱峰仍存在拖尾现象；430 nm波长下，只有蒽醌类物质有明显色谱峰（10个），选择430 nm作为检测波长不具代表性。应用DAD检测器，通过不同波长的比较确定检测波长为254 nm可较好地体现虎杖中各化学成分的特征。

HPLC-ELSD指纹图谱中1号（占总峰面积的20%～50%）、5号（占总峰面积0.466%～1.124%）和6号（占总峰面积0.396%～1.709%）色谱峰，在HPLC-DAD指纹图谱中未检测到信号，且1号峰经过确认为非溶剂峰。因此，证明了应用DAD与ELSD串联技术研究虎杖药材指纹图谱的必要性。同时HPLC-DAD指纹图谱中4、10、17、19号（大黄素甲醚）色谱峰在HPLC-ELSD指纹图谱中并未检测到，表明上述4种成分在虎杖中量较低或者属于易挥发性成分。