在药物开发及生产中膜分离技术的应用日趋成熟，如色谱检测、蛋白分离、除热原等，具有无加热反应、无二次污染等优势^{[1, 2, 3]}。但在实际应用中，随着膜组件使用周期增加或膜组件更换，往往出现 膜分离性能变化的现象，需要重新评估膜分离性能，但目前尚无简便可行的实验评估方法。从而导致延误研发与生产，限制膜分离技术应用。究其原因，随着膜使用时间的增长或者膜组件的更换，影响其分离性能的膜截留相对分子质量（MWCO）及膜孔径分布范围发生改变^[4]。现有膜孔径评价方法多由制膜企业掌控，而公开的方法中存在检测膜孔径的标准物价格昂贵、标准误规格不一、检测结果偏差大^{[5, 6, 7]}等问题，在制药企业中无法推广应用。为了解决制药过程中膜技术存在的上述问题，在前期积累的大量中药成分超滤数据的基础上^{[8, 9, 10]}，筛选出成分稳定且容易获得的三七总皂苷作为实验对象，以其中含有的三七皂苷R₁及人参皂苷Rg₁、Rb₁和Rd为标准物质，选择孔径相对标准的系列超滤膜进行分离数据积累，进而分析拟合运算，并对不同类型的超滤膜进行MWCO计算及孔径分布分析，建立并完善适用于制药行业中膜孔径评价方法。

XX8200230型蠕动泵，德国Merck Millipore公司；KQ-250E型超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；Millipore超滤膜，MWCO分别为1×10³、5×10³、1×10⁴、3×10⁴、5×10⁴、1×10⁵，材质为改良纤维素，德国Merck Millipore公司；待测超滤膜见表 1。Agilent 1100高效液相色谱仪，四元泵溶剂系统，在线脱气机，自动进样器VWD检测器，Agilent色谱工作站，美国安捷伦公司。

三七皂苷R₁（质量分数≥98%，批号110745- 200312）、人参皂苷Rg₁（质量分数≥98%，批号110703-200424）、人参皂苷Rb₁（质量分数≥98%，批号110704-200318）对照品，均购自原中国药品生物制品检定所；人参皂苷Rd对照品，质量分数≥98%，批号070319，上海融禾医药科技发展有限公司。三七总皂苷，批号20100701，云南玉溪万方天然药物有限公司；乙腈为色谱纯；水为超纯水。

表 1(Table 1)

表 1 待测超滤膜参数 Table 1 Parameters of being-measured ultrafiltration membranes 超滤膜 标示MWCO 使用周期/h 材质 型号 生产厂家 I 1×104 0 聚醚砜 ST 美国Synder Filtration公司 II 5×103 ＞500 改良纤维素 Pellicon 2 德国Merck Millipore公司 III 3×104 0 聚醚砜 MK 美国Synder Filtration公司 IV 5×104 0 聚醚砜 NUF 无锡耀天超滤设备有限公司 V 5×104 0 聚偏氟乙烯 TZ50 南京拓鉒医药科技有限公司 VI 5×104 0 聚醚砜 MQ 美国Synder Filtration公司

表 1 待测超滤膜参数 Table 1 Parameters of being-measured ultrafiltration membranes

精密称取三七总皂苷适量，超纯水溶解，0.45 μm微孔滤膜滤过，质量浓度为10 mg/mL，得三七总皂苷溶液。其中，三七皂苷R₁质量浓度为0.78 mg/mL，人参皂苷Rg₁质量浓度为2.72 mg/mL，人参皂苷Rb₁质量浓度为3.44 mg/mL，人参皂苷Rd质量浓度为0.76 mg/mL。

分别精密称取干燥至恒定质量的对照品三七皂苷R₁ 4.81 mg、人参皂苷Rg₁ 15.12 mg，人参皂苷Rb₁ 20.07 mg，人参皂苷Rd 5.02 mg置于5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得含4种成分质量浓度分别为0.962、3.024、4.014、1.004 mg/mL的混合对照品溶液。

取2～3 L三七总皂苷溶液置于超滤系统（图 1）中，为了排除膜组件中残留水及膜材质吸附等因素的影响，超滤操作温度22～25 ℃，操作压力＜0.1 MPa，待超滤膜与三七总皂苷溶液之间吸附-解吸附平衡后，从储液罐中取样为平衡液，进而进行超滤，待超滤完成后，从超滤液罐中取样为超滤液，分别进液相检测，并按下式计算三七总皂苷截留率（R）。

1-储液罐 2-进液管 3-蠕动泵 4-进液压力表 5-超滤膜 6-截留液压力表 7-截留液 8-调速阀 9-超滤液 10-超滤液罐 1-stock solution tank 2-inlet pipe 3-peristalticpump 4-pressure gage 5-ultrafiltration membrane 6-pressure gage 7-rejected solution 8-speed regulator valve 9-ultrafiltrate 10-ultrafiltrate tank 图 1 超滤过程示意图Fig.1 Ultrafiltration process diagram

R＝C_滤/C_平

取系列MWCO的Millipore超滤膜置于超滤系统（图 1）中，按照超滤操作规范方法，数据重复累计（n＝3），计算三七总皂苷溶液中三七皂苷R₁及人参皂苷Rg₁、Rb₁和Rd在不同MWCO超滤膜中的平均R，并对R与相应的超滤膜MWCO进行回归计算，形成供待测超滤MWCO拟合的回归方程。

Kromasil C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-水，梯度洗脱：0～20 min，20%乙腈；20～45 min，20%～46%乙腈；45～55 min，46%～55%乙腈；55～60 min，55%乙腈；体积流量1.0 mL/min，柱温25 ℃，检测波长为203 nm。色谱图见图 2。

1-三七皂苷R1 2-人参皂苷Rg1 3-人参皂苷Rb1 4-人参皂苷Rd 1-notoginsenoside R1 2-ginsenoside Rg1 3-ginsenoside Rb1 4-ginsenoside Rd 图 2 混合对照品 (A) 与样品 (B) 的HPLC图Fig.2 HPLC of mixed reference substances (A) and sample (B)

分别取混合对照品溶液20、10、5、2、1 μL，Agilent 1100高效液相色谱仪检测，以峰面积为纵坐标（Y），对照品溶液进样量为横坐标（X），得线性回归方程：三七皂苷R₁为Y＝155 X－131.8，R²＝0.998 1；人参皂苷Rg₁为Y＝261.9 X－57.96，R²＝0.999 3；人参皂苷Rb₁为Y＝297.4 X＋11.44，R²＝0.999 0；人参皂苷Rd为Y＝103.6 X－75.94，R²＝0.997 2；表明三七皂苷R₁在0.962～19.240 μg、人参皂苷Rg₁在3.024～60.480 μg、人参皂苷Rb₁在4.014～80.280 μg、人参皂苷Rd在1.004～20.080 μg各成分峰面积与进样量之间线性关系良好。

精密吸取混合对照品溶液10 μL，重复进样6次，按“2.4.1”项下色谱条件检测，色谱峰峰面积积分值的RSD分别为三七皂苷R₁ 0.48%，人参皂苷Rg₁ 0.85%，人参皂苷Rb₁ 1.41%，人参皂苷Rd 1.24%。

精密吸取按“2.1.1”项下方法处理的三七总皂苷溶液10 μL，分别于0、1、2、4、8、12、24 h进样，按“2.4.1”项下色谱条件检测，色谱峰峰面积积分值的RSD分别为三七皂苷R₁ 0.91%，人参皂苷Rg₁ 1.02%，人参皂苷Rb₁ 0.84%，人参皂苷Rd 1.36%，结果表明三七总皂苷溶液在24 h内稳定。

按“2.1.1”项下方法平行制备5份三七总皂苷溶液，按“2.4.1”项下色谱条件检测，各成分质量浓度的RSD分别为三七皂苷R₁ 1.57%，人参皂苷Rg₁ 1.51%，人参皂苷Rb₁ 2.03%，人参皂苷Rd 1.75%。

精密吸取质量浓度为10 mg/mL的三七总皂苷溶液6份，分别精密加入混合对照品适量，按“2.4.1”项下色谱条件进行定量测定，计算得平均回收率分别为三七皂苷R₁ 101.15%、人参皂苷Rg₁ 98.85%、人参皂苷Rb₁ 96.80%、人参皂苷Rd 102.03%，其RSD分别为1.43%、1.96%、2.05%、2.21%。

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，成分的R平均值与超滤膜MWCO分别采用线性、指数等方程进行拟合运算，回归系数大于0.98，拟合方程成立。

取待测超滤膜置于超滤系统中的超滤膜部位（图 1），按照超滤操作规范方法进行超滤取样，重复3次，HPLC检测并计算三七总皂苷中主要成分的平均R。通过与超滤积累数据对比，并采用拟合方程计算，分析待测超滤膜的MWCO及膜孔径分布范围。

三七总皂苷中含有的4个主要成分三七皂苷R₁及人参皂苷Rg₁、Rb₁和Rd的R累计数据见图 3，各成分在MWCO 1×10³～1×10⁵的超滤膜中呈现出不同的分离效果，随着超滤MWCO的增大或减小，三七皂苷R₁、人参皂苷Rg₁与人参皂苷Rb₁、Rd R差异表现出逐步增加进而逐步减小的趋势。

图 3 三七总皂苷的超滤累计RFig.3 Ultrafiltration cumulative Rof PNS

根据三七总皂苷中主要成分的R与超滤膜MWCO（M）数据之间的关联性，进行回归运算，发现MWCO在1×10³～1×10⁴及1×10⁴～1×10⁵内，MWCO与成分R之间呈现较好的线性或者指数方程关系，且各方程的回归系数（r）均大于0.98（表 2）。

表 2(Table 2)

表 2 MWCO与成分R之间的相关性 Table 2 Correlation between MWCO and R 成分 MWCO范围 关系方程 r 三七皂苷R1 1×103≤M≤1×104 R＝-6.19 M＋78.21 0.991 1×104＜M≤1×105 R＝-6.50 lnM＋31.6 0.985 人参皂苷Rg1 1×103≤M≤1×104 R＝-5.483 M＋71.34 0.993 1×104＜M≤1×105 R＝-6.35 lnM＋31.12 0.981 人参皂苷Rb1 1×103≤M≤1×104 R＝-0.359 M2＋1.678 M＋96.76 0.985 1×104＜M≤1×105 R＝109.2 e-0.03 M 0.997 人参皂苷Rd 1×103≤M≤1×104 R＝-0.283 M2＋1.465 M＋97.85 0.990 1×104＜M≤1×105 R＝123.7 e-0.03 M 0.991

表 2 MWCO与成分R之间的相关性 Table 2 Correlation between MWCO and R

① 待测滤膜按照超滤规范操作，在规定的操作压力和温度下，排除膜材质对三七总皂苷中成分的影响，进而取样检测、分析，计算成分的R；② 将待测超滤膜呈现出的三七总皂苷中成分的截留结果与图 3中的累计R对比，初步确定MWCO范围；③ 根据超滤膜孔径落在1×10³～1×10⁴或1×10⁴～1×10⁵，分别采用方程中适宜的区间进行计算，确定膜MWCO分布范围。

根据图 4中的三七总皂苷的超滤累计R与图 3对比，初步确定待测超滤膜的MWCO分别为超滤膜I 1×10⁴左右、超滤膜II 5×10³～1×10⁴、超滤膜III 3×10⁴左右、超滤膜IV～VI均在5×10⁴左右。进而选择相应方程进行计算，结果见表 3。

图 4 待测超滤膜的三七总皂苷的超滤累计RFig.4 Ultrafiltration cumulative R of being-measured ultrafiltration membranes of PNS

表 3(Table 3)

表 3 待测超滤膜拟合MWCO Table 3 Fitting MWCO of being-measured ultrafiltration membranes 待测超滤膜 （标示MWCO） 拟合MWCO 拟合MWCO 分布范围 三七皂苷R1 人参皂苷Rg1 人参皂苷Rb1 人参皂苷Rd I（1×104） 9 800 9 900 10 100 10 000 9 800～10 100 II（5×103） 7 000 6 500 6 800 6 700 6 500～ 7 000 III（3×104） 27 600 26 800 36 500 35 100 26 800～36 500 IV（5×104） 47 500 46 800 58 300 60 700 47 500～60 700 V（5×104） 52 100 51 400 50 500 50 700 50 500～52 100 VI（5×104） 48 300 49 100 53 400 56 100 48 300～56 100

表 3 待测超滤膜拟合MWCO Table 3 Fitting MWCO of being-measured ultrafiltration membranes

待测超滤膜生产企业采用聚乙二醇为标准物质检测其MWCO，但是作为标准物质使用的聚乙二醇检测成本高，且检测方法不被制药企业所掌握。选用三七总皂苷作为标准物质检测的结果见表 3，分析数据发现，聚醚砜材质的超滤膜I拟合MWCO范围与其标示MWCO基本一致，说明三七总皂苷在亲水性材质的聚酰胺与改良纤维素具有相似的超滤行为；长期使用的超滤膜MWCO呈现出增大的现象，从而也改变了其分离性能；MWCO为3×10⁴美国Synder Filtration超滤膜（III）的拟合结果为26 800～36 500，说明其孔径分布相较于3×10⁴ Millipore超滤膜更为宽泛。针对具有相同MWCO、不同生产厂家的超滤膜进行检测计算，发现三者之间存在差异，其中超滤膜IV MWCO分布范围较宽，超滤膜V MWCO相对准确，而引起拟合MWCO差异的原因可能是制膜厂家的制膜工艺不同或采用的标准物质聚乙二醇相对分子质量分布范围偏大。

超滤膜MWCO是衡量膜分离性能的重要参数，其检测和标定均是由膜生产厂家完成，而真正的膜使用单位尚没有方法评价新采购或已使用超滤膜的分离性能，这是影响膜使用单位生产效率及其产品质量稳定性的主要原因。本实验提供了一种简便、可行且成本较低的超滤膜MWCO检测方法，适用于MWCO在1×10³～1×10⁵的亲水性超滤膜。

同时，为了保证方法结果的准确性，本实验前期对相关影响因素进行了摸索优化，首先需要排除膜材质与成分之间吸附-解吸附的影响，采用不同超滤平衡时间的条件下，检测计算膜组件对成分的动态吸附率从而确定平衡时间。进而为了排除浓差极化，经过试验摸索，发现在操作压力小于0.1 MPa的前提下，浓差极化对结果的影响较小。此外，三七总皂苷质量浓度对其R有影响，R与质量浓度在一定程度上呈正相关，如果降低或升高质量浓度会导致R偏高的人参皂苷Rb₁和Rd检测结果不稳定，因此最终确定三七总皂苷的质量浓度在10 mg/mL左右，结果准确，可重复。

新型膜材质的开发是膜分离行业的发展方向之一^{[12, 13, 14]}，相同孔径但材质不同的超滤膜其分离特征存在明显的差别，针对目前超滤膜多为亲水性材质，本实验仅对亲水性材质改良纤维素进行了三七总皂苷的超滤分离规律研究，对亲水性材质的超滤膜孔径评价相对适用，疏水性材质超滤膜的孔径评价方法尚需进一步完善。

目前，生产上超滤膜的MWCO范围为1×10³～1×10⁶，本实验提供的方法仅适用于MWCO在1×10³～1×10⁵的超滤膜，因此存在一定的局限性。但是，中药中成分的多样性决定了尚有未发现的且适用于超滤膜MWCO检测的中药成分，因此需要逐步的积累中药成分的超滤分离数据，总结规律，筛选适用于超滤MWCO计算的中药成分，进一步完善适用于超滤膜MWCO简便、快速、可行的检测方法，从而从根本上提升超滤技术在制药行业中的适用性。