黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi. 的干燥根，作为传统中药材，具有治疗炎症、呼吸道感染、失眠、腹泻、痢疾、高血压等作用^[1]。《中国药典》2010年版规定以黄芩苷作为评价黄芩药材质量标准^[2]。研究发现黄芩苷具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗感染、抗HIV、抗氧化及清除氧自由基和治疗心血管疾病等作用^[3]。目前，黄芩苷的生物合成途径与其关键酶基因表达之间的关系仍处于研究阶段。

查耳酮异构酶（chalcone isomerase，CHI，EC5.5.1.6）是第一个被认识的黄酮类化合物合成相关酶，也是黄酮代谢途径中的关键酶之一。相关研究证明，黄芩毛状根中CHI基因的表达量与黄酮（黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素）生物量呈正相关^[4]。1987年研究者利用抗体技术首次从法国豌豆中分离出CHI基因^[5]。随后从矮牵牛Petunia hybrida Vilm.、菜豆Phaseolusvulgaris Linn.、玉米Zea mays Linn.等^{[6, 7, 8]}大多数维管植物中克隆分离得到。CHI催化分子内反应，使双环的柚皮苷查耳酮异构化形成有生物学活性的三环2S-二羟基黄烷酮。根据反应底物的不同将CHI基因分为2种类型^[9]，一类CHI基因仅能催化6′-羟基查耳酮转化为5-羟基黄烷酮，存在 于非豆科植物；另一类CHI基因存在于豆科植物中能催化6′-羟基查耳酮和6′-脱氧查耳酮转化为相应的5-羟基黄烷酮和5-脱氧黄烷酮。研究发现有些细菌和真菌中也发现CHI基因的存在^[10]，将其划分为第3类。

本实验对黄芩苷生物合成途径中的CHI基因（sbCHI）进行克隆与生物信息学分析，旨在从基因水平上研究黄芩苷生物合成途径的调控机制，实现黄芩苷合成基因的高效表达，增加药效成分量。为深入研究CHI家族蛋白的酶学特性和黄酮类生物合成的分子机制提供理论依据。

黄芩Scutellaria baicalensis Georgi. 愈伤组织，由吉林农业大学中药材学院植物研究室提供。经吉林农业大学韩梅教授鉴定。于超净工作台中将愈伤组织放于自封袋中于−80 ℃保存备用。

EASYspin Plus Plant RNA Kit、2×Taq PCR MasterMix购自北京艾德莱生物科技有限公司，高纯质粒小量制备试剂盒、DNA连接试剂盒、多功能DNA纯化回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，M-Mulv第一链cDNA购自上海生工生物工程有限公司，LB培养基、DH5α感受态细胞购自大连宝生物工程有限公司。MDF-382E超低温冰箱（日本SANYO），HC-2518R高速冷冻离心机，PCR扩增仪（Mastercycler nexus），凝胶成像系统[GIS-2010，天能科技（上海）有限公司]，制冰机（SIM-F140，SANYO），电泳仪（DYY-8C型，北京六一电泳厂）。

1.3.1 总RNA提取和cDNA合成

取小块黄芩愈伤组织于液氮中速冻，研钵研成细粉状，按EASYspin Plus Plant RNA Kit使用说明，提取黄芩愈伤组织总RNA。利用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。利用M-Mulv第一链cDNA试剂盒以Oliga-dT为引物，合成黄芩愈伤组织cDNA链。

反应体系（12 μL）为总RNA模板10 μL，RNase Free H₂O 1 μL，5 μg/μL Oliga 1 μL。反应条件为65 ℃水浴5 min后，立即放于冰上冷却30 s，然后离心3～5 s。5倍反应缓冲液 4 μL，20 U/μL Rnase Inhibitor 1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，20 U/μL M-Mulv RT 1 μL。反应条件为42 ℃水浴90 min，70 ℃变性10 min，放于冰上5 min。逆转录DNA于−20 ℃保存。

根据GenBank上已报道的黄芩CHI基因cDNA（HQ153041.1）序列，使用软件Primer Primer5.0设计引物，上游引物为sbCHI-F：5’-ATGGGTTTTCAGGTTTGGC-3’，下游引物为sbCHI-R：5’-TCACTTCCCAGCAGGTTTT-TCAC-3’。以黄芩的cDNA为模板，按照以下体系对sbCHI基因进行扩增：cDNA 1.0 μL，2×Taq酶9 μL，10 μmol/L上下游引物各0.8 μL，ddH₂O 8.4 μL，终体积为20.0 μL。反应程序为94 ℃预变性3 min；然后进行35个循环：94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；循环结束后72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对扩增所得的目的片段进行切胶回收。

将纯化回收的目的片段与pGEM-T easy载体连接，再转化到DH5a感受态细胞中，涂布在氨苄青霉素（Amp）、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖（X-gal）和异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）的LB平板上进行培养，随机挑取12个白色单克隆经菌落PCR扩增和电泳检测后选择阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序。

将所测定的sbCHI基因序列在NCBI上通过Blast搜索蛋白质和核苷酸数据库，并由DNAMAN软件翻译成氨基酸序列，使用ORF Finder查找开放阅读框（ORF）。生物信息学分析主要采用一些网上在线软件进行分析，如采用Interpro（http://www.ebi. ac.uk/Tools/InterPro-Scan/）进行结构域比对，ExPASy在线服务器的Compute PI/Mw（http://web.expasy.org/compute_pi/）预测相对分子质量与理论等电点，TargetP1.1 server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）进行信号肽分析，SWISS-MODEL（http://swissmodel. expasy.org/）进行二级结构分析和结构域的三维同源建模。用DNAMAN软件对序列进行多重比对，用ClustalW软件与其他植物的CHI氨基酸序列进行比较，用MEGA 5.1软件构建Neighbor-joining系统进化树，bootstrap 重复次数为1 000次。

2.1 sbCHI基因的克隆

对黄芩愈伤组织的总RNA进行浓度和纯度检测，得到的RNA质量浓度为115 ng/μL、A₂₆₀/A₂₈₀的值为1.817，表明所提取的总RNA完整性和纯度较好，可用于下一步实验。根据Genbank中已公布的黄芩CHI基因的CDS设计引物，以黄芩愈伤组织RNA反转录得到的cDNA为模板，利用PCR技术扩增得到一条长为648 bp的序列（图 1-A），为区别于Genbank中的1条黄芩CHI基因，将所扩增基因命名为sbCHI，并将核酸序列提交到NCBI中的GenBank数据库，登陆序列号为KP064512。

A-sbCHI基因的扩增 B-sbCHI基因纯化回收的检查结果 C-重组质粒pGEM-T easy-sbCHI的电泳检测 D-重组质粒pGEM-T easy-sbCHI的阳性克隆检测结果；1～3、7～18-sbCHI基因条带 4～6-pGEM-T easy-sbCHI条带 M-Marker A-ORF amplification of sbCHIgene B-detection of recover purified sbCHIgene C-gel detection of pGEM-T easy-sbCHI D-detection of positive clones of pGEM-T easy-sbCHI 1—3, 7—18-sbCHI 4—6-pGEM-T easy-sbCHI M-Marker 图 1 sbCHI基因的克隆Fig.1 Cloning of sbCHI

将PCR产物进行纯化回收，回收结果见图 1-B，连接到pGEM-T easy载体上。将于4 ℃条件下连接过夜的CHI/pGEM-T easy载体转化到DH5α感受态细胞中，涂布到LB平板培养基上培养，对随机挑取的12个单克隆菌落进行菌落PCR（图 1-D）。挑取3株有阳性克隆的菌落进行测序，同时提取这3株菌落的重组质粒（图 1-C）。

利用ExPASy Proteomics Server的在线软件Protparam预测sbCHI基因编码蛋白的理化性质。CHI编码的蛋白由215个氨基酸组成（图 2），分子式为C₁₀₃₇H₁₆₃₄N₂₅₈O₃₂₁S₄，总原子数为3 254。相对分子质量为22 980，理论等电点5.09，带负电基（Asp＋Glu）为26，带正电基（Arg＋Lys）为21。不稳定指数为47.93，表明该蛋白不稳定。脂溶指数（aliphatic index）为85.30。总平均亲水性（GRAVY）为−0.034，通常根据GRAVY值范围在−2～2，正值表明此蛋白为疏水性蛋白，负值表明此蛋白为亲水性蛋白，故sbCHI基因编码蛋白为亲水性蛋白。

图 2 sbCHI基因的cDNA和编码氨基酸Fig.2 cDNA of sbCHI and its deduced amino acid sequence of S. icalensis

采用SWISS-MODEL进行sbCHI的编码蛋白二级结构分析和结构域预测。sbCHI编码蛋白的二级结构中，α-螺旋（alpha helix）占37.21%、β-延伸（β-extended）占23.25%、无规卷曲（random coil）占39.54%。蛋白质的空间结构决定了其功能作用，α-螺旋主要对蛋白质骨架起稳定作用，而无规则卷曲结构决定了蛋白质尤其是酶的功能部位常常位于这种构象区域，通过对蛋白质二级与三级结构预测和分析，有助于理解蛋白质功能与结构的关系^[11]。

InterProScan的结构域预测结果（图 3）表明，sbCHI基因编码蛋白在5～215位，包含一个查耳酮超级家族结构域。如图 4所示，三维同源模型以4doi.1.A蛋白为模板，序列同源性为50%，用于建立该模型的氨基酸残基范围为6～214位，从图 2中可以看出，sbCHI基因预测的编码蛋白二级结构与三级结构预测结果相符合。

图 3 InterProScan在线软件预测sbCHI基因编码蛋白的保守结构域Fig.3 Conserved domain prediction of sbCHI encoding protein using InterproScan

图 4 sbCHI编码蛋白三维结构的预测Fig.4 Deduced 3D structure of sbCHI coding protein

通过Signal P4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）对蛋白信号肽预测，如图 5，S值表示每个氨基酸对应1个S值，图表中有一个曲线显示S值的变化趋势，信号肽区域的S值较高。C值是剪切位点值。每个氨基酸会有一个C值，在剪切位点处C值是最高的。Y值是Y-max综合考虑S值和C值的一个参数，其比单独考虑C值要更精确。因为在一条系列中C值可能有不止一个较高的位点，但是剪切位点只有一个，此时的剪切位点就由Y-max值来推测的，为< /span>S值是陡峭的位置和具有高C值的位点。当C值最大，S值陡峭，Y值最高峰时，就可以预测为信号肽的切位点。分析可知该蛋白没有信号肽。利用TMHMM Server v. 2.0（http://www.cbs.-dtu.dk/services/ TMHMM/）预测可知sbCHI编码蛋白跨膜螺旋数为0，结果见图 6，可知此蛋白无跨膜区。TargetP 1.1 Server 在线工具分析结果显示，此蛋白定位于叶绿体中的值为0.634、定位于线粒体中的值为0.030、定位于其他位置中的值为0.275，因此sbCHI基因编码蛋白最可能定位于叶绿体中。且分泌通道信号肽（SP）得分为0.337，而只有当SP值接近1时预测可能有信号肽，这与利用Signal P4.1进行信号肽预测结果一致。

图 5 蛋白信号肽预测图Fig.5 Prediction of protein signal peptide

图 6 蛋白跨膜区预测图Fig.6 Prediction of protein transmembrane domain

利用DNAMAN软件，将sbCHI编码蛋白氨基酸序列与GenBank中已公布的菊花、藿香、三花龙胆、紫苏、黄芩进行序列比对（图 7），相似性分别为64.24%、69.29%、64.86%、75.69%、99.07%。其中紫苏CHI基因和藿香CHI基因与sbCHI同属于唇形科较其他植物的氨基酸序列相似性高，sbCHI基因与黄芩（ADQ13184.1）核苷酸相似性为99.69%、氨基酸相似性为99.07%，仅在31位的亮氨酸和苯丙氨酸不同、160位的甘氨酸和半胱氨酸不同。

图 7 黄芩和其他植物的CHI编码氨基酸的序列分析Fig.7 Multiple alignment of putative amino acids sequence of sbCHI with those of cloned CHI in other plants

为了分析sbCHI基因编码蛋白的进化情况，从GenBank数据库中共选取了17个物种的19条CHI序列，经过软件Clustal W比对并利用MEGR5.0中的neighbor-joining方法^[12]。构建了植物、细菌不同生物CHI基因的进化树如图 8所示，这些序列分别聚类为单子叶植物、双子叶植物、双子叶植物唇形科、细菌门，其中单子叶植物和双子叶植物同属于第一类、双子叶植物唇形科属于第二类、细菌门属于第三类。其中sbCHI基因与唇形科的藿香、紫苏聚类为一支，与黄芩（ADQ13184.1）亲缘最近，和同源性分析结果相同，同属于第一类。这与实验预期相符，在一定程度上说明克隆得到的sbCHI基因为黄芩CHI基因。

图 8 CHI编码蛋白系统进化树Fig.8 Phylogenetic tree of sbCHI and their related sequences

CHI在黄芩苷形成的代谢途径中，主要催化双环的柚皮苷查耳酮异构化形成有生物学活性的三环2S-二羟基黄烷酮，是关键酶之一。从1987年首次得到第一个CHI基因，随后陆续从矮牵牛、藿香、紫苏、三花龙胆、黄芩等大多数植物中克隆获得CHI基因。除了在植物中发现CHI基因，在一些细菌、真菌中也克隆出CHI基因。

植物黄酮类化合物在植物中的积累，受CHI基因表达量的影响。通过荧光定量PCR对银杏叶片中CHI基因进行分析，结果显示查耳酮异构酶的活性和查耳酮异构酶基因的表达量与叶片中的黄酮类化合物的积累相关^[13]；利用酵母提取物和PEG8000处理甘草毛状根，提高CHI基因的表达量，结果甘草毛状根中的类黄酮化合物的量明显增加^[14]；通过对黄芩毛状根中CHI基因进行过表达处理和基因沉默处理，发现黄芩毛状根中黄酮类物质相应的增加和减少。这些研究在一定程度上说明了CHI基因的表达量与植物中黄酮类化合物呈正相关。

本实验首次以黄芩愈伤组织为材料，克隆了sbCHI基因的全长cDNA，长度为648 bp，包含1个ORF，共编码215个氨基酸，并对其进行生物信息学分析，预测CHI相对分子质量大小和等电点分别为22 980和5.09，为不稳定的亲水性蛋白；二级结构中以α-螺旋、β-延伸以及无规卷曲为主，保守结构域属于查耳酮超级家族。通过同源性分析及系统进化树分析，发现sbCHI基因与藿香、紫苏唇形科植物的亲缘较近，氨基酸序列相似性最高仅有75.69%，说明物种间的差异比较大。类黄酮生物合成通过苯丙氨酸代谢途径，是目前最为清楚的植物次生代谢产 物合成途径。黄芩作为一种重要的药用植物，黄芩苷是黄芩中量最高的类黄酮化合物。目前，关于黄芩类黄酮代谢途径的上游基因均已克隆获得，下游基因研究较少，至于黄芩调节基因研究还未有报道。关于黄芩CHI基因在转录水平的变化已有研究报道，为了更深入了解黄芩CHI基因，应用生物信息学方法对sbCHI基因编码的蛋白进行序列比对、分析，从而对其结构和功能进行推断和预测，为该基因的功能研究提供科学依据。