酸枣仁Ziziphi Spinosae Semen是《中国药典》2010年版收载的养心安神药^[1]，属于卫生部颁布的第一批药食同源两用品，其药用历史悠久，《神农本草经》列为上品，《本草纲目》列为本部类^[2]。酸枣仁味酸、性平，具有补肝宁心、镇静安神、敛汗、生津等功效，主要用于治疗虚烦不眠、惊悸多梦、体虚多汗、津伤口渴等症，是河北省道地药材^[3]。

酸枣仁的主要化学成分有皂苷类、黄酮类、生物碱类等。现代药理研究表明酸枣仁中皂苷类和黄酮类化合物是其镇静催眠的主要有效成分^[4]。其中酸枣仁皂苷A和斯皮诺素是《中国药典》2010年版所规定的酸枣仁的活性成分，白桦脂酸也以其抗肿瘤活性备受关注。目前，已有文献报道了一些酸枣仁活性成分（酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素和白桦脂酸）的测定分析方法，包括高效液相色谱（HPLC）^[5,6,7]、超高效液相色谱（UPLC）^[8] 和胶束毛细管电泳（MEKC）^[9]等。但这些方法分析周期长，所测成分单一，因此，为了进一步有效控制酸枣仁的质量，提高临床用药的安全性，需要建立一个可靠、准确的分析方法来对其多组分进行同时测定。

本研究建立了HPLC-ESI-MS/MS法同时测定酸枣仁药材中9种化学成分，并将其应用于不同来源市售酸枣仁的质量分析，可为酸枣仁药材的质量控制提供科学依据。 1 仪器与试药 1.1 试药

对照品酸枣仁皂苷A（批号110734-200510）、酸枣仁皂苷B（批号110814-200607）、芦丁（批号100080-200707）均购自中国食品药品检定研究院（质量分数均大于98%）；斯皮诺素（批号121220）购自成都普菲德生物技术有限公司（质量分数大于98%）；白桦脂酸（批号100904）、白桦脂醇（批号zl20140326）均购自南京泽朗医药科技有限公司（质量分数均大于98%）；芹菜素（批号101129）购自上海融禾医药科技有限公司（质量分数大于98%）；柚皮苷（批号FY17910711）、橙皮苷（批号FY11290618）均购自南京飞宇生物技术股份有限公司（质量分数均大于98%）。

乙腈为色谱纯（美国J. T. Baker公司）；水为纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；甲酸为色谱纯（美国Dikma公司）；其他试剂均为分析纯。酸枣仁Ziziphi Spinosae Semen取自不同产地酸枣Ziziphus jujuba Mill. var.spinosa (Bunge) Hu ex H. F. Chou，由河北医科大学药学院生药学李连怀副教授鉴定。样品具体信息见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 酸枣仁样品 Table 1 Samples of Ziziphi Spinosae Semen 编号 代码 来源地 1 承德-1 河北承德 2 承德-2 河北承德 3 赞皇-1 河北赞皇 4 赞皇-2 河北赞皇 5 赞皇-3 河北赞皇 6 山西-1 山西 7 山西-2 山西 8 云南 云南

表 1 酸枣仁样品 Table 1 Samples of Ziziphi Spinosae Semen

Agilent1200高效液相色谱仪，配有在线脱气机，四元泵，自动进样器（美国Agilent公司）；3200QTRAP^TM三重四级杆线性离子阱质谱仪，配有ESI离子源（美国AB公司）；Analyst 1.5.2 software数据系统（美国AB公司）；SCQ-200超声波清洗器（100 W，25 kHz）（上海声谱超声波设备厂）；BP211D型十万分之一天平（德国Sartorius公司）。 2 方法与结果 2.1 分析条件 2.1.1 色谱条件

色谱柱Sapphire C₁₈柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为水（A，1 mmol/L乙酸铵-0.1%的甲酸）-乙腈（B），梯度洗脱（0～2 min，20%～95% B；2～12 min，95% B），进样前按流动相初始条件平衡6 min；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL。对照品和样品的提取多反应监测模式（MRM）色谱图见图 1。

图 1 对照品 (A)、酸枣仁样品 (B) 的多重反应监测色谱图和对照品二级质谱图 (C) Fig. 1 MRM chromatograms of reference substances (A) and Semen Ziziphi Spinosae samples (B)and second mass spectrum of reference substances (C)

离子源为电喷雾离子化源（ESI）；MRM进行定量分析；采用负离子检测模式；源喷射电压（IS）为-4 500 V；离子源温度为650 ℃；雾化气（GS1，N₂）压力为413.70 kPa；辅助气（GS2，N₂）压力为448.18 kPa；气帘气（N₂）压力为206.85 kPa。接口加热，全程通入氮气，MRM模式定量。监测的离子对，解簇电压（DP）和碰撞能量（CE）见表 2。9种被测成分的二级质谱图见图 1。

表 2(Table 2)

表 2 酸枣仁中9种成分的质谱数据 Table 2 HPLC-ESI-MSn data of nine constituents from Ziziphi Spinosae Semen 成分 相对分子质量 tR /min 离子源模式 MS1(m/z) MS2 (m/z) DP/V CE/eV 酸枣仁皂苷A 1 207.35 3.76 ESI- 1 206.2 1 206.2 -91 -27 酸枣仁皂苷B 1 045.21 3.93 ESI- 1 043.4 1 043.4 -134 -24 斯皮诺素 608.54 3.69 ESI- 607.3 292.0 -122 -70 白桦脂酸 456.71 9.87 ESI- 455.3 455.3 -97 -20 白桦脂醇 442.72 3.69 ESI- 487.4 487.4 -58 -13 芹菜素 270.24 4.35 ESI- 260.0 116.8 -80 -51 芦丁 610.51 3.69 ESI- 609.0 300.0 -95 -49 橙皮苷 610.56 3.69 ESI- 610.2 301.3 -74 -36 柚皮苷 580.53 3.68 ESI- 579.2 150.8 -92 -56

表 2 酸枣仁中9种成分的质谱数据 Table 2 HPLC-ESI-MSn data of nine constituents from Ziziphi Spinosae Semen

分别称取对照品酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素、白桦脂酸、白桦脂醇、芦丁、芹菜素、橙皮苷、柚皮苷适量，精密称定，加75%甲醇制成对照品溶液。分别取各对照品溶液适量，摇匀，即得酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素、白桦脂酸、白桦脂醇、芦丁、芹菜素、橙皮苷、柚皮苷的混合对照品溶液，质量浓度分别为12.000、25.000、5.313、175.000、327.500、95.000、0.231、80.000、0.375 μg/mL。 2.2.2 供试品溶液的制备

将洁净酸枣仁于40 ℃条件下干燥8 h，研磨后过40目筛。取酸枣仁粉末约5 g，置于索氏提取器中，用石油醚（60～90 ℃）浸泡过夜（8 h），脱脂2次，每次2 h，回收石油醚。将脱脂粉末挥尽残醚至无醚味，精密称取1 g酸枣仁脱脂粉，转移至25 mL具塞三角瓶中，精密加入75%甲醇20 mL，称质量，冰浴超声1 h，再称质量，用75%甲醇补足减失的质量，取上清液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。 2.3 方法学考察 2.3.1 线性关系、定量限和检测限

精密量取上述混合对照品溶液适量，采用倍数稀释法进行稀释，得到6个不同质量浓度的系列对照溶液，按照上述色谱和质谱条件进行分析，并记录色谱峰面积。以对照品的质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，并进行线性回归，得标准曲线方程（表 3）。将混合对照品溶液逐步稀释并进行测定，分别以信噪比为10和3时各对照品的量作为定量限（LOQ）和检测限（LOD）。结果9种待测组分的质量浓度和峰面积的相关系数（r）均大于0.998 4，表明该方法的线性关系良好，各组分的回归方程、线性范围、检测限（LOQ）和定量限（LOD）见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 9种成分的回归方程、相关系数、线性范围、定量限和检测限 Table 3 Regression equations,correlation coefficients,linear ranges,LODs,and LOQs of nine constituents 成分 标准曲线方程 r 线性范围/(μg·mL-1) LOD/(ng·mL-1) LOQ/(ng·mL-1) 酸枣仁皂苷A Y＝476.37 X＋7.965 2 0.999 7 0.375～12.00 86.600 0 350.630 0 酸枣仁皂苷B Y＝353.86 X－81.920 0.999 6 0.781～25.00 104.690 0 318.800 0 斯皮诺素 Y＝74 838 X＋66 546 0.998 4 0.166～5.313 0.734 4 2.447 9 白桦脂酸 Y＝245 066 X＋5 000 000 0.998 7 5.469～175.0 5.469 0 10.940 0 白桦脂醇 Y＝248.21 X＋24 711 0.998 4 20.47～655.0 843.750 0 2 109.4 芹菜素 Y＝253 404 X－623.01 0.999 0 0.007～0.231 0.104 6 1.156 3 芦丁 Y＝6 779.3 X＋359.2 0.999 7 0.578～18.50 0.115 6 0.385 4 橙皮苷 Y＝8 012.3 X－1 207.4 0.999 6 0.156～10.00 12.500 0 31.250 0 柚皮苷 Y＝14 562 X＋65.046 0.998 7 0.012～0.375 0.031 3 0.093 8

表 3 9种成分的回归方程、相关系数、线性范围、定量限和检测限 Table 3 Regression equations,correlation coefficients,linear ranges,LODs,and LOQs of nine constituents

取同一批号（赞皇-3）酸枣仁样品，取约1 g，精密称取6份，按“2.2.2”项下操作，制备供试品溶液，在“2.1”色谱条件下记录9种化合物的峰面积，计算RSD值，考察日内精密度。取同一批号（赞皇-3）酸枣仁样品，取约1 g，精密称取6份，按“2.2.2”项下操作，制备供试品溶液，在上述色谱条件下记录9种待测成分的峰面积，连续3 d测定计算RSD值，考察日间精密度。结果显示日内精密度及日间精密度的RSD值分别小于0.38%和0.47%，表明该方法精密度良好。 2.3.3 加样回收率试验

精密称取已测定的酸枣仁样品0.5 g，分别精密加入高、中、低3个水平的对照品溶液，每个水平3份，共9份，按“2.2.2”项下方法操作，制备供试品溶液。按上述的色谱条件测定9个化合物的峰面积，计算回收率及RSD值。结果9种被测成分的平均回收率为98.04%～101.5%，RSD值为0.03%～0.74%。 2.3.4 稳定性试验

取同一供试品溶液（赞皇-3），分别于0、2、4、8、12、24 h进样分析测定，记录峰面积，考察供试品溶液的稳定性。结果表明所有被测物峰面积的RSD＜0.42%，说明样品稳定性良好。 2.3.5

重复性试验 取同一批号（赞皇-3）酸枣仁样品，取约1 g，精密称取6份，按“2.2.2”项下操作，制备供试品溶液，在“2.1”色谱条件下记录9种化合物的峰面积，计算RSD值，考察重复性。9种化合物的RSD值均小于0.38%，符合规定，表明本方法重复性良好。 2.4 样品测定

取不同批次的酸枣仁样品，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下的条件进行测定，记录色谱峰面积，将9个待测成分的峰面积代入相应的标准曲线方程中，并计算其质量分数。不同批号的酸枣仁的测定结果见表 4。

表 4(Table 4)

表 4 酸枣仁中9种成分的测定结果 Table 4 Determination of nine constituents in Ziziphi Spinosae Semen 样品编号 质量分数/(μg·g-1) 酸枣仁皂苷A 酸枣仁皂苷B 斯皮诺素 白桦脂酸 白桦脂醇 芹菜素 芦丁 橙皮苷 柚皮苷 1 4.83 8.85 1.42 120.78 54.93 0.23 1.73 0.45 0.32 2 3.88 10.91 1.36 108.11 55.73 0.14 1.56 0.38 0.38 3 3.82 4.89 1.65 109.92 68.82 0.07 12.44 1.30 0.41 4 4.77 6.25 1.65 116.30 67.24 0.08 16.76 1.70 0.39 5 5.08 6.73 1.75 115.80 65.27 0.07 13.64 1.44 0.34 6 3.99 5.40 1.50 56.72 32.04 5.40 15.14 1.50 0.09 7 3.10 4.54 1.62 53.48 30.96 4.89 14.72 1.43 0.11 8 2.05 4.05 0.78 29.38 6.89 0.05 1.48 0.32 未检到

表 4 酸枣仁中9种成分的测定结果 Table 4 Determination of nine constituents in Ziziphi Spinosae Semen

8批酸枣仁中9种成分的总量在45.00～215.14 μg/g，表明这9种成分在不同产地不同批次的酸枣仁中的总量有明显的不同，样品4、5和3的总量最高，分别是215.14、210.12、203.32 μg/g，样品1和2的总量次之，为193.54和182.45 μg/g，而样品8（伪品滇枣仁）量最低，为45.00 μg/g。7批正品酸枣仁的平均量是177.3 μg/g。平均质量分数最高的成分是白桦脂酸97.30 μg/g，接着是白桦脂醇53.57 μg/g，芦丁10.86 μg/g，酸枣仁皂苷B 6.80 μg/g。芹菜素、橙皮苷和柚皮苷是平均量较低的成分，而柚皮苷在伪品滇枣仁中没有检测到。从整体来看，河北赞皇的酸枣仁有效成分量高，河北承德次之，山西第三，伪品酸枣仁量最低。这些分析结果表明不同产地甚至是相同产地不同批次的酸枣仁中9种待测物的量存在着很大差异。 3 讨论

本实验首次建立了一种快速、准确的HPLC- MS/MS分析方法，用于同时测定酸枣仁中的9种化合物（酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素、白桦脂酸、白桦脂醇、芦丁、芹菜素、橙皮苷、柚皮苷）。该方法成功检测了市售常见的8批酸枣仁样品，结果表明不同产地或是相同产地不同批次的酸枣仁9种成分的量存在着差异。HPLC-MS/MS方法为酸枣仁的质量控制提供了可靠地分析手段。

实验比较了以50%、75%、90%、100%甲醇，75%乙醇，纯乙醇为提取媒介，提取供试品，结果表明以75%甲醇提取效率较高。之后比较了超声提取及加热回流提取效果，2种方式提取率相近，由于超声提取相对方便快捷，因此选择超声提取法。此外还考察了提取30、45、60、90 min对待测成分的提取效果，结果表明超声提取60 min，提取效率较高。

流动相的选择，分别以甲醇-水、乙腈-水作为流动相进行梯度洗脱，结果表明以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱时9种待测物均有很好的分离，所以选择乙腈为流动相。为改善峰形，比较了乙腈-甲酸（0.05%、0.1%、0.2%和0.3%）为流动相时的分离效果，结果显示乙腈-0.1%甲酸水峰形较好。为了提高皂苷类化合物在质谱中的离子稳定性，在流动相中加入了乙酸铵（0.5、1、2、3 mmol/L），结果显示流动相为水（1 mmol/L乙酸铵-0.1%的甲酸）-乙腈时，峰形更好。