鱼腥草Houttuynia cordata Thunb. 为三白草科鱼腥草属多年生草本植物，因全株有鱼腥味而得名。鱼腥草营养价值很高，是人们常用的野生蔬菜^[1,2]，鲜鱼腥草氨基酸包括Asp、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Ala、Arg、Tyr、Val、Met、Phe、Ile、Leu、Lys和Pro 16种氨基酸^[3]，干鱼腥草地下部分中蛋 白量为7.1%～10.5%，可溶性糖为7.1%～11.4%，脂肪为4.6%～9.3%^[4,5,6]，鱼腥草中脂溶性维生素和水溶性维生素量均很丰富。其全草均可入药，已被国家卫生部正式确定为“既是药品，又是食品”的极具开发潜力的资源之一^[7]。鱼腥草中脂溶性维生素种类丰富，可能与其中挥发油量较高有关。挥发油是鱼腥草的重要有效成分，主要含萜类化合物，乙酰辅酶A酰基转移酶（acetyl-CoA C-acetyltransferase，AACT）是其甲羟戊酸（mevalonate，MVA）合成途径的第一个重要酶，能使2个分子的乙酰辅酶A缩合为乙酰乙酰辅酶A。AACT催化蛋白质的酰基化和去酰基化已成为真核生物蛋白质修饰中最普遍的方式之一，能调节蛋白质生物活性和基因表达，直接影响植物的生长发育及主要活性成分的合成，具有重要的研究意义。

目前，AACT基因序列已在油茶^[8]、假马齿苋^[9]、丹参^[10]、显齿蛇^[11]等作物及药用植物中成功克隆，迄今鱼腥草AACT基因还未见有任何报道。本研究应用RT-PCR方法扩增鱼腥草AACT基因cDNA片段，并对其蛋白质序列进行生物信息学及不同组织器官中的特异性表达分析，为有效利用该基因和合理开发鱼腥草的药食两用价值奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂

鱼腥草Houttuynia cordata Thunb. 样品经中央民族大学龙春林教授鉴定，种植于怀化学院鱼腥草种植园，于2012年6月28日采集同一株鱼腥草的地下茎、地上茎、叶片、花等样品，洗净后，经乙醇擦拭及焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液处理，立即放入液氮中保存，带回实验室，于-80 ℃冰箱保存备用。

RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒、Taq酶、克隆载体pMD 18-T Vector、质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒、菌种JM109、DNA相对分子质量标记，T4 DNA连接酶、荧光定量试剂盒SYBR Prime Script^TM RT-PCR Kit及电泳类试剂等均购自TaKaRa公司。 1.2 方法 1.2.1 RNA的提取

鱼腥草地下茎、地上茎、叶片及花RNA提取方法按照Trizol试剂说明书进行，提取后进行电泳检测和纯度及浓度测定；并于-80 ℃保存备用。 1.2.2 cDNA链合成

根据试剂盒说明书进行，反转录产物分离纯化后置于-20 ℃保存备用。 1.2.3 引物设计

通过分析鱼腥草高通量转录组数据，发现一个被注释为AACT基因的转录本（CL8227），同其他植物AACT基因的核苷酸序列（AB294686、HQ128554、KC342946、FJ947159、GU594059）进行比对，应用Oligo 6软件设计引物。上游引物AACT-F：5’-ATGGCTCCTGCAGCAGCT- TC-3’；下游引物AACT-R：5’-TTACATGAGCTC-TAGCACA-3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 1.2.4 PCR扩增

反应体系和反应条件参照文献报道^[12]，其中退火温度为56 ℃。 1.2.5 扩增片段的克隆测序、序列分析及AACT生物信息学分析

对PCR产物进行回收，连接载体pMD 18-T Vector，并转化感受态细胞JM109，蓝白筛选后，过夜培养白色菌落，提取质粒并鉴定，然后送生工物工程（上海）有限股份公司测序。采用DNAStar软件包分析与处理序列，在NCBI网站上进行Blast比对及BioEdit软件分析，并用Mega 4软件进行UPMAG聚类分析。采用ExPASy Proteomics Server 提供的在线工具对鱼腥草AACT基因编码蛋白的理化性质及结构与功能进行预测。 1.2.6 实时荧光定量

PCR 表达分析 利用实时荧光定量PCR的方法检测AACT基因在鱼腥草根（地下茎）、茎（地上茎）、叶、花中的相对表达量，采用美国ABI7500实时PCR检测系统，上游引物qAACT-F序列为5’-ATTACTGGGTATGCTGATG-C-3’，下游引物qAACT-R序列为5’-TTTCCCGA-TGGAAGGTCT AG- 3’。实时PCR检测的反应体系如下：5 μL 2×SYBR^® Premix Ex Taq^TM，正、反向引物均为0.3 μL，cDNA模板2 μL；加ddH₂O至10 μL。反应程序：95 ℃、3 min，95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，72 ℃、30 s，35个循环，实时PCR反应以鱼腥草18 S rDNA为内参，18 S rDNA序列设计引物18 S-F：5’-CCTCCGGCGTTGTTACT- TTG-3’和18 S-R：5’-CCCGACT GTCCCTG TAATCA- 3’，每个反应重复3次。 2 结果与分析 2.1 鱼腥草AACT基因克隆

以总RNA反转录所得到的第一链cDNA为模板，用引物AACT-F和AACT-R进行PCR扩增。电泳检测发现约在1 200 bp处有一条亮带，见图 1。对于扩增产物进行测序，其结果经Blast确定为鱼腥草AACT基因序列，经ORF Finder预测，该序列含有一个完整的开放阅读框（ORF），推测编码405个氨基酸，见图 2。

图 1 鱼腥草AACT基因的PCR扩增 Fig. 1 PCR amplification of AACT gene from H. cordata

图 2 鱼腥草AACT基因的核苷酸序列及推测的氨基酸序列 Fig. 2 Nucleic acid sequence and supposed amino acid sequence of AACT gene from H. cordata

鱼腥草AACT基因预测编码405个氨基酸，利用ExPASy在线软件对其蛋白的理化性质进行预测分析。推测其分子式为C₁₈₁₂H₂₉₅₂N₅₁₄O₅₆₃S₁₉，相对分子质量是41 555.6，等电点（pI）为6.13。该蛋白的不稳定系数（instability index）为30.59，属于稳定蛋白。脂肪系数（aliphatic index）为96.69，亲水性系数（grand average of hydropathicity）为0.188，该蛋白不含信号肽。 2.2.2 鱼腥草AACT的二级结构及三级结构预测

AACT蛋白的二级结构如图 3所示，该蛋白的二级结构中α-螺旋占42.96%、β-折叠占15.06%、无规则卷曲占32.59%、自由延伸占9.38%。由SWISS-MODEL预测的AACT三级结构如图 4所示。

图 3 AACT蛋白二级结构预测图 Fig. 3 Two-dimensional structure prediction of AACT protein

图 4 AACT蛋白三级结构预测图 Fig. 4 Three-dimensional model prediction of AACT protein

推导氨基酸序列比较结果表明，鱼腥草AACT与橡胶树、油茶、山茶、三角叶杨、假马齿苋、小米、马铃薯、罗汉果、玉米和番茄的AACT蛋白质分子的相似度分别为87.2%、84.9%、84.7%、83.0%、82.7%、80.8%、80.2%、80.0%、79.8%和79.5%，表明AACT氨基酸序列同源性高，进化过程中比较保守。用Mega 4软件进行UPMAG聚类分析，见图 5。

图 5 鱼腥草与其他植物AACT的UPGMA进化树 Fig. 5 UPGMA cladogram of AACT from H. cordata and other plants

利用实时荧光定量PCR检测AACT基因在地下茎、地上茎、叶、花等器官中的表达特异性，结果表明该基因在地上茎中的表达量最高，达到1.49，其次是地下茎0.96，花和叶中的表达量相对较低，分别为0.20和0.10（图 6）。

图 6 鱼腥草不同组织中AACT基因的相对表达量 Fig. 6 Relative expression quantity of AACT gene in different parts of H. cordata

鱼腥草既是传统中药材，也是口味独特的菜肴，营养成分和药用成分的量丰富。鱼腥草属野生宿根性草本植株，在我国南方各地均有其嫩茎叶及肥嫩的根茎出售，被称为纯天然绿色食品、野菜中的佳品、高档蔬菜，其脆嫩、纤维少、口感好，深受消费者称道。民间对鱼腥草的食用历史悠久，方法多种多样，特别是在人民生活水平普遍提高，崇尚绿色自然的当今社会，其食用范围越来越广，食用人群越来越多^[2,12]。鱼腥草为药食两用的植物，早在唐代《新修本草》有“叶似荞麦，肥地亦能蔓生，茎紫赤色，多生湿山谷阴处，山南江左人好生食之”的记载。根据《南本草》《本草经疏》等古代医学书籍记载，鱼腥草具有清热解毒、化痰止咳、杀菌消炎、排脓消肿、利尿和化食的功效，可治疗肺炎、肺脓肿、热痢、疟疖、水肿、痔疮、中暑、肠胃炎等多种疾病^{[13,14,15,16,17]}。这同鱼腥草含有丰富的挥发油有关。挥发油中主要成分为萜类化合物，而AACT是其MVA合成途径中的第一个发挥重要作用的关键酶，是近年来植物生理生化和分子生物学研究的热点之一。随着对MVA途径关键酶的深入研究，利用酶表达改变萜类物质在植株中的量，必将是改变植株品质的有效手段之一。

本研究利用RT-PCR技术首次克隆了鱼腥草AACT基因的全长cDNA序列。所克隆的AACT基因含一个完整的ORF，编码405个氨基酸。对推导的氨基酸序列的结构和功能进行生物信息学分析，发现其没有信号肽序列。与其他植物的氨基酸序列进行比较，结果显示，鱼腥草AACT同其他植物AACT具有较高的相似性，说明该蛋白在进化过程中比较保守。这可能与其在植物生命活动过程中所发挥的作用有关。

本研究首次成功克隆了鱼腥草AACT基因cDNA序列，将为构建其过表达载体和遗传转化体系，进一步实现萜类成分在植株中高效表达提供理论基础，并为开展鱼腥草及类似以萜类化合物为主要活性成分植物的遗传改良、品质提高具有重要的理论意义和实践价值。