芪骨胶囊是上海名中医石印玉教授在长期的临床实践中摸索出来的经验方。该药由淫羊藿、肉苁蓉、制首乌、骨碎补、黄芪、石斛、菊花7味中药组成，具有补肾壮骨的功效，主要适用于中医辨证属于肝肾不足证型的原发性骨质疏松症^[1]。

目前芪骨胶囊的企业质量控制方法采用TLC法对成品中黄芪等药材进行定性鉴别，采用HPLC法对方中淫羊藿苷进行定量测定，但由7味药物组成的芪骨胶囊成分复杂，仅以一两种有效成分不能从整体上反应其内在质量。本实验对芪骨胶囊开展HPLC指纹图谱研究，并对指纹图谱中主要特征峰进行化学指认以及组方中药来源的初步确定，综合运用相似度评价、聚类分析等识别技术，为制定全面而整体的芪骨胶囊质量控制方法提供实验依据。

HPLC—20AT高效液相色谱分析仪、UFLC—20A高效液相色谱仪，日本岛津公司；API 3200三重四极杆串联质谱仪（美国AB公司）；KQ—250E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）。

柚皮苷（批号20120221，质量分数≥98%）、松果菊苷（批号20121125，质量分数≥98%）、朝藿定B（批号20120928，质量分数≥98%）、朝藿定C（批号20120618，质量分数≥98%）、淫羊藿苷（批号20120706，质量分数≥98%），均购自上海源叶生物科技有限公司；15批芪骨胶囊（批号S1：110101-1、S2：110701、S3：111101、S4：120301、S5：120401、S6：120501&l t;/ span>、S7：120503、S8：120505、S9：120701、S10：121101、S11：121201、S12：130101、S13：130102、S14：130301、S15：130302），单味药以及阴性药均由厦门中药厂有限公司提供；各单味药淫羊藿、肉苁蓉、制首乌、骨碎补、黄芪、石斛、菊花均经福建中医药大学药学院杨成梓副教授鉴定，分别为小檗科淫羊藿属植物淫羊藿Epimedium brevicornum Maxim. 的干燥叶、列当科肉苁蓉属植物肉苁蓉Cistanche deserticola Y. C. Ma的干燥带鳞叶的肉质茎、蓼科何首乌属植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb. 的干燥块根的炮制加工品（符合《中国药典》2010年版规定）、水龙骨科骨碎补属植物槲蕨Drynaria fortune (Kunze) J. Sm. 的干燥根茎、豆科黄芪属植物膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge的干燥根、兰科石斛属植物金钗石斛Dendrvbium nobile Lindl. 的干燥茎、菊科菊属植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat. 的干燥头状花序。

甲醇、乙腈为色谱纯，水为纯化水。

色谱柱为Platisil-C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇-乙腈-水为流动相，按表 1程序进行梯度洗脱；体积流量为1 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为270 nm；进样量为10 μL。

表 1(Table 1)

表 1 流动相梯度洗脱条件 Table 1 Gradient elution conditions of flow phase t / min 甲醇 / % 乙腈 / % 水 / % t / min 甲醇 / % 乙腈 / % 水 / % 0 4 1 95 47 17 26 57 10 11 7 82 57 25 34 41 33 13 19 68 67 50 33 17 37 13 22 65

表 1 流动相梯度洗脱条件 Table 1 Gradient elution conditions of flow phase

离子源扫：ESI；描方式：正、负离子扫描；减簇电压（DP）：50 V；Q1入口电压（EP）：10 V；碰撞室入口电压（CEP）：10 V；碰撞室出口电压（CXP）：2.0 V；离子源电压（IS）：5 500 V；碰撞电压（CAD）：8.0 V；温度（TEM）：500 ℃；气帘气（CUR）：172.40 kPa；GS1：344.80 kPa；GS2：379.28 kPa；碰撞离子强度CE：137.90 kPa。

取松果菊苷、柚皮苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇配成质量浓度分别为310.73、62.99、37.78、86.33、97.59 μg/mL的混合对照品溶液，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液作为混合对照品溶液，即得。

取芪骨胶囊内容物约0.55 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30 mL甲醇，超声30 min（50 ℃，250 W，40 kHz），放冷，用甲醇补足减失的质量，滤过，取续滤液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，备用。

芪骨胶囊的各单味药材与阴性供试液的制备，按芪骨胶囊的企业制备标准，并按“2.4“项下的方法处理，即得单味药材与阴性供试液。

精密称定芪骨胶囊内容物（批号110101-1）约0.55 g，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件连续进样6次，记录色谱图，以淫羊藿苷为参照峰，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果各共有峰相对保留时间的RSD均＜0.12%，相对峰面积的RSD均＜2.31%，符合指纹图谱要求，表明仪器精密度良好。

精密称定芪骨胶囊内容物（批号110101-1）约0.55 g，按“2.4”项下分别制备供试品6份，按“2.1”项下条件进样分析，以淫羊藿苷为参照峰，结果各共有峰相对保留时间的RSD均＜0.13%，相对峰面积的RSD均＜3.65%，符合指纹图谱要求，表明仪器精密度良好。

精密称定芪骨胶囊内容物（批号110101-1）约0.55 g，按“2.4”项下制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，以淫羊藿苷为参照峰，结果各峰相对保留时间的RSD均＜0.11%，相对峰面积的RSD均＜2.59%，符合指纹图谱技术要求，表明供试品溶液在24 h内稳定。

分别制备15批芪骨胶囊供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，记录色谱图。根据15批芪骨胶囊HPLC指纹图谱的检测结果，生成芪骨胶囊共有模式的对照指纹图谱。

分析15批芪骨胶囊HPLC色谱图，因为16号峰（淫羊藿苷）是淫羊藿的主要成分，也是其主要活性成分之一，且淫羊藿是复方的君药；淫羊藿苷与相邻峰分离较好，其量较高且相对稳定，因此以16号峰（淫羊藿苷）为参照峰（S峰），将各色谱峰保留时间和保留峰面积与同一图谱中S峰的保留时间和保留峰面积比值，即得到相对保留时间和相对峰面积，计算15批芪骨胶囊指纹图谱中各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，确定芪骨胶囊指纹图谱中的16个色谱峰为其共有特征峰，见图 1。

图 1 混合对照品 (A) 与对照指纹图谱 (B) Fig.1 Chromatogram of mixture reference substances (A) and reference fingerprint (B) of Qigu Capsules

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004A版）将将15批不同批次芪骨胶囊指纹图谱数据导入，以第15批药材图谱作为参照谱进行指纹匹配，采用中位数法生成对照谱，匹配结果见图 2。得出15批芪骨胶囊的相似度计算结果，见表 2。从结果可以看出，相似度大于0.9，表明15批胶囊的化学成分分布较稳定。

图 2 15批芪骨胶囊的HPLC指纹图谱 Fig. 2 HPLC fingerprints of 15 batches of Qigu Capsules

表 2(Table 2)

表 2 15批芪骨胶囊的HPLC指纹图谱 Table 2 Similarities of 15 batches of Qigu Capsules 编号 相似度 编号 相似度 编号 相似度 S1 0.971 S6 0.964 S11 0.992 S2 0.987 S7 0.996 S12 0.984 S3 0.95 S8 0.964 S13 0.993 S4 0.944 S9 0.967 S14 0.992 S5 0.967 S10 0.972 S15 0.992

表 2 15批芪骨胶囊的HPLC指纹图谱 Table 2 Similarities of 15 batches of Qigu Capsules

分别精密吸取单味药材及阴性缺味供试品溶液，注入液相色谱仪，采集色谱图。对保留时间一致且阴性样品图谱中未出现的色谱峰进行分析比较，并根据紫外光谱信息，确认指纹图谱共有峰的药材归属。通过对比分析，结果表明在16个共有峰中，峰11、13、14、15、16号峰来自淫羊藿药材；峰2、5、8来自肉苁蓉药材；峰4、9来自骨碎补药材；峰3、12来自黄芪药材；峰7、10来自菊花药材；峰6来自制首乌药材，见图 3。

图 3 芪骨胶囊与各单味药HPLC图 Fig.3 HPLCfingerprint of Qigu Capsules and its single herb medicine

利用对照品对各峰的成分进行指认，分别精密吸取供试品溶液、混合对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，见图 1。通过各峰保留时间定位和化学成分的PDA光谱图信息对比，对各峰进行指认。共指认了5个色谱峰，分别为2号峰（松果菊苷）、9号峰（柚皮苷）、14号峰（朝藿定B）、15号峰（朝藿定C）、16号峰（淫羊藿苷）。

为进一步阐明芪骨胶囊的化学组成，采用UFLC-ESI-MS/MS技术对HPLC指纹图谱指认，由于芪骨胶囊中的化学成分、结构差别较大，故同时采用正、负离子模式进行扫描。通过质谱中分子离子峰和碎片离子峰的分子量匹配，结合紫外吸收光谱特征，相关文献^{[2, 3, 4, 5, 6]}以及对照品对照，鉴定了芪骨胶囊指纹图谱中8个色谱峰的化学成分，结果见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 芪骨胶囊指纹图谱化学成分质谱归属 Table 3 MS attribution of chemical components in HPLC fingerprint of Qigu Capsules 峰号 t / min 化合物 相对分子质量 准分子离子峰 [M－H]-/ [M＋H]+ MS/MS (m/z) 2 29.06 松果菊苷 786 785.1 623.0、477.0 4 34.54 新北美圣草苷 596 597.0 451.5、435.1、289.0 5 34.99 毛蕊花糖苷 624 623.0 416.3、315.1 9 39.36 柚皮苷 580 581.1 527.1、419.3 13 53.09 朝藿定A 838 839.0 531.1、369.1 14 54.05 朝藿定B 808 809.3 531.4、369.2 15 55.02 朝藿定C 822 823.4 531.1、369.1 16 55.99 淫羊藿苷 676 677.5 531.3、369.2

表 3 芪骨胶囊指纹图谱化学成分质谱归属 Table 3 MS attribution of chemical components in HPLC fingerprint of Qigu Capsules

将峰面积数据标准化（即对同一变量减去其均值，再除以标准差，以消除原始数据之间的量纲影响），采用SPSS 19.0统计分析软件中的系统聚类法中的类间平均链锁法，选取欧氏距离平方作为样品测度。利用此方法对15批芪骨胶囊进行系统聚类分析，绘出树状图，见图 4。由聚类结果可知：15批样品大体上分为3类，批次S1、S2与S5～S15归为一类，说明13个批次的样品均较接近，S3、S4分别单独归为一类，其中，S3的15号峰比其他批次高，S4的3、7、10号峰较高。而且S3、S4的相似度在15批次中相对较小，说明聚类和相似度分析结论基本一致，2种方法得到了相互印证。

图 4 聚类分析树状图 Fig. 4 Fig. 4 Dendrogram of cluster analysis

以HPLC图谱的出峰灵敏度和分离完整性为标准，通过对不同溶媒进行筛选，结果以甲醇溶液提取，效果较好。在提取方法上，对超声、回流与索氏提取方法作了平行比较，结果显示甲醇超声30 min的提取方法总峰面积较大，提取效率较高，最后选用甲醇超声30 min的提取方法。

在流动相选择上，筛选了甲醇-乙腈与水、磷酸溶液、冰醋酸及甲酸溶液等组合，结果以甲醇-乙腈-水组合的梯度洗脱效果最佳。在检测波长选择方面关注了各药材主要有效成分，分别对208、254、270、283、330 nm进行筛选，确定检测波长270 nm比较适合，此时大部分色谱峰达到基线分离，各色谱峰的吸收较强。

本实验建立了芪骨胶囊的HPLC指纹图谱，通过相似度计算和聚类分析可知芪骨胶囊的批间稳定性较高，故能够用来控制本品的质量，以保证不同批次产品质量的一致性，从而为芪骨胶囊制备工艺稳定性提供重要依据。