甜叶菊Stevia rebaudiana Bertoni又名“甜菊”、“甜草”，菊科甜叶菊属，原产南美洲巴拉圭的Amambay及Mbaxacayu山脉^[1]，甜叶菊糖苷有控制血糖、降低血压、促进新陈代谢的作用，具有治疗糖尿病、肥胖症、调节胃酸、恢复神经疲劳之功效^{[2, 3]}，可用于医药工业作矫味剂和辅料，因此，甜叶菊逐渐成为医药领域研究和开发的热点。但甜叶菊是一种盐敏感植物，土壤的盐碱化对甜叶菊的生长及品质影响较大，而我国的耕地随着化肥的大量使用盐碱化现象越来越严重，因而选育耐盐性强、适应性广的甜叶菊新品种就显得尤为重要。鉴于常规育种周期长，加之甜叶菊属于异花授粉植物，不利于杂交种后代的纯合及优良品种的防杂保纯，采用诱变与组织培养技术相结合的离体化学诱变方法可以提高突变频率，因此化学诱变不失为甜叶菊育种中一种行之有效的技术手段。

作为一种应用较多的化学诱变剂，甲基磺酸乙酯（EMS）在植物诱变育种中得到广泛的应用^[4]。通过组织培养技术有目的筛选耐盐变异体是获得耐盐品种的有效途径之一，目前人们已在多种植物中通过离体培养筛选耐盐突变体获得成功，如番茄^[5]、草莓^[6]、百合^[7]、猕猴桃^[8]等。国内外有关甜叶菊组织培养方面的研究已开展了30多年，无论在理论上还是技术上都取得了长足发展^[9]，但有关甜叶菊EMS离体诱变的研究尚未见报道。本研究以甜叶菊无菌组培苗带腋芽（腋芽未萌发）茎段为试验材料，以EMS为诱变剂进行耐盐变异体的诱变和筛选，并通过相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）标记进行鉴定，以期为甜叶菊耐盐突变体的应用提供理论依据和技术支撑。

供试材料为安徽科技学院农学组培室提供的甜叶菊“皖甜1号”组培苗。化学诱变剂EMS无色油状透明液体为美国Sigma公司生产。本实验基本培养基为MS培养基，诱变培养基采用MS＋蔗糖30 g/L＋琼脂5.5 g/L的普通培养基。培养条件为温度（25±2）℃，光照2 000～4 000 lx、14 h/d，相对湿度60%左右。

配制含NaCl为0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和1.2%的MS培养基，将生长良好的甜叶菊组培苗，接种于上述培养基中。40 d后观察甜叶菊组培苗生长状况，统计甜叶菊的存活率和生根率，以存活率0～10%为甜叶菊耐盐性筛选的临界浓度^[10]。

取生长健壮的甜叶菊组培苗，剪去叶片，剪成含2个腋芽的茎段（长1～1.5 cm），置于装有不同质量分数EMS（0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和1.2%）的无菌三角瓶中，在转速为60 r/min的摇床上分别浸泡2、4、6、8、10、12 h，共42个处理。处理完毕后用无菌水冲洗4～5次、无菌滤纸吸干表面水分，接种于MS培养基上，每处理9瓶，每瓶4个外植体，接种45 d，考察组培苗的存活率，选成活率约为50%时的处理时间和质量分数为EMS适宜的诱变质量分数和时间。

在筛选出甜叶菊EMS诱变适宜的时间和质量分数基础上，建立约含300个左右腋芽的诱变群体。将腋芽剪下接种于含1.0% NaCl的MS培养基上进行耐盐性变异体的初步筛选。接种45 d观察甜叶菊组培苗生长状况，并将存活的单株编号，继代培养后用于后续的SRAP分子鉴定。

将经诱变后在1.0% NaCl质量分数下存活的单株进行扩繁，用胡能兵等^[11]改良的CTAB法提取甜叶菊叶片DNA，通过SRAP分子标记对耐盐变异体进行分子鉴定。首先以未作任何处理的甜叶菊组培苗为材料，对36个引物组合进行引物筛选（引物具体序列见表 1，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成），以条带清晰的8对引物（F2R2、F2R5、F3R3、F4R4、F4R5、F4R6、F5R1和F5R4）对41个变异株进行SRAP检测。SRAP反应体系为：Taq DNA聚合酶（5 U/μL）1.0 μL，10×DNA 缓冲液（含15 mmol/L MgCl₂）3.0 μL，2.5 mmol/L的dNTPs 1.2 μL，DNA模板0.5 μL，10 μmol/L正、反引物各0.75 μL，双蒸水12.8 μL。PCR反应程序为：94 ℃变性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，5个循环；接着94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。银染方法参照文献方法^[12]。

表 1(Table 1)

表 1 选用SRAP引物代号及序列 Table 1 Code numbers and sequences of Selected SRAP primers 正向引物 序列 (5’→3’) 反向引物 序列 (5’→3’) F1 TGAGTCCAAACCGGAAA R1 GACTGCGTACGAATTAAA F2 TGAGTCCAAACCGGAAT R2 GACTGCGTACGAATTAAT F3 TGAGTCCAAACCGGAAC R3 GACTGCGTACGAATTAAC F4 TGAGTCCAAACCGGAAG R4 GACTGCGTACGAATTAAG F5 TGAGTCCAAACCGGATA R5 GACTGCGTACGAATTATA F6 TGAGTCCAAACCGGATT R6 GACTGCGTACGAATTATT

表 1 选用SRAP引物代号及序列 Table 1 Code numbers and sequences of Selected SRAP primers

由图 1可知，随着NaCl质量分数的升高，甜叶菊组培苗长势逐渐变弱；当NaCl为0.8%时，甜叶菊组培苗生长受到明显抑制，植株变矮，叶片瘦弱并伴有黄化现象，接近培养基的叶片变褐，部分茎段出现生长缓慢；当NaCl增加到1.0%时，甜叶菊组培苗停止生长，叶片变小变黄，随着胁迫时间延长叶片开始脱落，几乎所有植株都不能生根；当NaCl增加到1.2%时，甜叶菊组培苗全部出现焦化现象，生长受到绝对抑制，全部死亡，致死率达100%。

图 1 不同质量分数NaCl处理甜叶菊组培苗生长情况Fig.1 Growth situation of S. rebaudiana tissue culturing seedlings under different NaCl concentration

甜叶菊组培苗接种至含有不同NaCl质量分数的MS培养基40 d统计存活率和生根率。随着NaCl处理质量分数的增加，甜叶菊组培苗存活率和生根率逐渐下降；当NaCl质量分数小于0.4%时，甜叶菊组培苗的存活率与CK无显著差异，NaCl质量分数大于0.6%时差异显著；当NaCl质量分数小于0.2%时，甜叶菊组培苗的生根率与CK无显著差异，NaCl质量分数大于0.4%时差异显著；当NaCl质量分数为0.8%时，存活率（32.50%）和生根率（27.50%）均低于50%；当NaCl质量分数为1.0%，存活率为3.13%，生根率为0；当NaCl质量分数为1.2%时组培苗全部死亡。刘艳萌等^[10]研究认为，筛选真正的耐盐变异体，选择压力必须达到足以能够使绝大多数个体不能正常生长发育，因此，本实验结合甜叶菊组培苗的长势、存活率、生根率，初步确定甜叶菊（“皖甜1号”）耐盐胁迫的临界NaCl质量分数为1.0%。

甜叶菊组培苗在EMS不同质量分数和处理时间下的生长情况有很大区别，随着EMS质量分数的增大和处理时间的延长，甜叶菊组培苗长势逐渐变弱，株高逐渐变小，顶芽和腋芽生长速度较慢；与未经EMS处理的甜叶菊组培苗（CK）相比茎较细，叶片数量减小，茎叶失绿黄化，甚至死亡。CK在基本培养基中生长旺盛，苗较粗，叶片肥大，叶色深绿且有光泽，根较长（图 2-A）；当EMS质量分数超过0.8%，处理时间超过8 h时后，有约一半的甜叶菊茎段死亡，甜叶菊生长缓慢，叶片黄化（图 2-B～C）；当EMS质量分数达到1.2%和处理时间为12 h，甜叶菊茎段全部死亡（图 2-D）。

A-CK B-1.0% EMS, 8 h C-0.8% EMS, 10 h D-1.2% EMS, 12 h 图 2 EMS 处理质量分数和时间组合对甜叶菊组培苗生长的影响 Fig.2 Effect of combination of EMS concentration and treatment time on growth of S. rebaudiana tissue culturing seedlings

表 2为EMS处理后的甜叶菊组培苗存活率。由表 2可知，低质量分数EMS、短时间的处理，对甜叶

表 2(Table 2)

表 2 不同EMS质量分数和处理时间对甜叶菊组培苗存活率的影响 Table 2 Effect of different EMS concentration and treatment time on survival rate of S. rebaudiana tissue culturing seedlings 处理时间 / h 存活率 / % 0 0.2% EMS 0.4% EMS 0.6% EMS 0.8% EMS 1.0% EMS 1.2% EMS 2 100.00 96.67 95.00 95.00 95.00 95.00 91.67 4 100.00 98.33 98.33 96.67 93.33 93.33 71.67 6 100.00 96.67 95.00 93.33 91.67 91.67 41.67 8 98.33 95.00 91.67 68.33 68.33 48.33 16.67 10 93.33 93.33 91.67 68.33 51.67 41.67 10.00 12 98.33 86.67 75.00 60.00 43.33 38.33 0.00

表 2 不同EMS质量分数和处理时间对甜叶菊组培苗存活率的影响 Table 2 Effect of different EMS concentration and treatment time on survival rate of S. rebaudiana tissue culturing seedlings

菊组培苗存活率影响相对较小，随着EMS质量分数的升高和处理时间的延长，甜叶菊组培苗存活率明显降低。当EMS质量分数在1.0%以内，处理时间在2～6 h，甜叶菊组培苗存活率均保持在90%以上；当EMS质量分数大于1.0%，处理时间长于8 h或质量分数大于0.8%，处理时间长于10 h，甜叶菊组培苗的存活率均在50%以下。通常以组培苗的半致死剂量作为EMS处理的最适宜剂量，综合考虑诱变效果及组培苗的存活率，本实验初步确定EMS诱变甜叶菊（“皖甜1号”）组培苗茎段（带腋芽）的适宜质量分数和时间范围为0.8%～1.0% EMS处理8～10 h。

挑选培养25 d左右生长健壮的甜叶菊生根组培苗，剪成长约1 cm带腋芽的茎段（剪去叶片），经1%～1.0% EMS处理8～10 h后接种在MS继代培养基上，将存活的组培苗继代3次后，再接种在含1.0% NaCl的MS培养基上进行诱变苗的耐盐性筛选，反复筛选3代后，利用非突变体的不可遗传性，去除生理适应性甜叶菊苗，存活的植株即为耐盐变异株。将耐盐变异株接种到1.0% NaCl的MS培养基上（处理和对照各接种300个茎段），45 d统计存活率，经过EMS 处理过的甜叶菊茎段存活41株，存活率为13.67%，对照存活10株，存活率为3.33%。

为进一步确定经EMS处理后植株的耐盐性，将经过1.0% NaCl反复筛选出来的41株甜叶菊组培苗分别编号扩繁后提取DNA并进行SRAP分子标记鉴定。图 3为部分引物对甜叶菊变异株SRAP扩增图谱。在所用的引物对中，F2R2、F4R4、F5R5可以从DNA水平检测突变体，引物F2R2可检测出2个变异单株，分别为第16、25号，与CK相比，16号单株共缺失4条带（箭头所示），但在100～200 bp比其他单株多扩增1条带，25号单株则在1 000 bp的位置缺失1条带。引物F4R4能够检测出3个变异单株，分别为25、32和34号，与CK相比，3

图 3 部分引物的甜叶菊变异株SRAP扩增图谱Fig.3 SRAPamplification map of S. rebaudianamutants by several primers

个单株都是在约600 bp处缺失1条带。引物F5R5能检测出32号变异单株，具体表现为在200～300 bp和300～400 bp处各缺失1条带。由此可知，EMS可以引起甜叶菊组培苗在DNA水平发生变异，经SRAP分子标记检测，其特征主要表现为部分扩增带的缺失或增加。基于上述结果，41株变异株有4个单株在DNA水平发生了序列的改变，突变率为9.76%。

不同植物、不同品种的耐盐性一般存在一个阈值，这主要是由于基因型和植物起源地的生境所决定的。研究表明，草莓离体叶片再生植株耐盐的临界质量分数为0.8%^[10]，猕猴桃组培苗的耐盐阈值为1.2 g/L^[8]，百合组培苗耐盐阈值以1.0%为宜^[13]。本实验综合考虑不同盐质量分数胁迫下的长势、存活率和生根率认为，甜叶菊组培苗耐盐阈值为1.0%较合适，此结论与在铁皮石斛上研究结果有所不同，高于铁皮石斛茎叶分化耐盐筛选的临界质量分数为0.5%^[14]。有关不同品种甜叶菊组培苗的耐盐性临界质量分数的确定还需进一步广泛系统研究。

目前EMS已在多种植物的诱变育种中得到了广泛应用，并获得了有研究或利用价值的突变体。但是在药用植物上的应用却相对较少。周立名等^[8]研究表明，当诱变率达50%致死剂量时，EMS处理质量分数为6%、处理时间为2 h时，对猕猴桃的处理效果最佳。郑文娟等^[15]用EMS诱变越橘时表明，诱变处理的最佳组合为3% EMS处理4 h。薛惠丹等^[16]用EMS诱变花椒愈伤组织的LD₅₀为0.3% EMS处理6 h、0.5% EMS处理4 h、0.7% EMS处理2 h。从上述的研究结果可知，不同的植物材料EMS诱变适宜质量分数和时间差异较大，一般即愈伤组织和叶片诱变所需的EMS质量分数较小（0.2%～0.4% EMS）、时间短（2～4 h），茎段和种子诱变所需的EMS质量分数约为0.6%～1.0%，诱变时间短6～10 h。本实验结果表明，随着EMS质量分数的升高和处理时间的加长，甜叶菊茎段组培苗存活率逐渐下降，考虑到高质量分数的EMS会对植株造成很大的损伤，综合考虑诱变效果与植株存活率，本实验最终确定EMS诱变甜叶菊（“皖甜1号”）组培苗茎段的适宜质量分数和LD₅₀组合为0.8%～1.0%EMS处理8～10 h。

突变体鉴定中目前应用较多的分子标记有随机扩增多态性DNA（RAPD）、限制性片段长度多态性（RFLP）、简单重复系列（SSR）及SRAP等，与其他标记相比，SRAP标记具有简便、高效、产率高、高共显性、重复性好、易测序、便于克隆目标片段的特点，到目前为止，已成功应用于丹参^[17]、灵芝^[18]、川续断^[19]、忍冬^[20]等药用植物的分子鉴定。本实验SRAP标记结果表明，从41株存活的甜叶菊组培苗耐盐变异体中检测出4个DNA序列发生改变的单株，单株变异率为9.75%，高于李彩华等^[21]运用EMS在唐菖蒲中的报道，但低于何克勤等^[22]运用NaN₃在甜叶菊的研究。

由于本研究的主要目的是建立甜叶菊EMS离体诱变体系，并通过SRAP鉴定获得甜叶菊耐盐突变体。为了更全面、系统地鉴定甜叶菊组培苗耐盐突变体，还需从形态、细胞学以及田间表现等方面综合鉴定；变异株与非变异株的抗性、解剖结构与化学成分（糖苷）等的比较是今后研究的重点。