黄柏为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid. 的干燥树皮，习称“川黄柏”^[1]。《中国药典》2010年版（以下简称“药典”）将来源于芸香科的植物黄檗Phellodendron amurense Rupr. 的干燥树皮收录为“关黄柏”。黄柏作为传统中药材已有上千年药用历史，其性味苦寒，有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮之功效^[2]。现代药理学研究表明黄柏具有广泛的药理活性，如抗菌、抗病毒、镇咳、降压以及增强免疫等^{[3, 4, 5, 6]}。由于黄柏生长缓慢、周期长、见效慢，一般在10年以上才可采收。目前国家已禁止野生黄柏等42种国家重点保护的野生动植物上市交易，黄柏的供应可能在多年后会出现较大缺口，价格也将逐年攀升，直接威胁到企业的生产成本。因此，尽可能在较短生长年限（3～5年内）获得生物碱量大的黄柏植株或部位，基于此从而建立黄柏丰产栽培体系，缩短黄柏种植周期，提高农民种植积极性，将有效缓解黄柏资源供给不足的现状，满足制药企业对黄柏资源的要求。

黄柏中主要活性成分为生物碱，其中小檗碱量最高。本实验采用高效液相色谱（HPLC）对不同生长树龄、不同采收时间、不同采收部位的黄柏中的小檗碱和黄柏碱的量变化进行研究，目的是在尽量短的生长时间内获得较高小檗碱的积累水平的原料，并确定最佳年份和最佳采收部位。

Agilent 1260 Series高效液相色谱仪，包括G1329B在线脱气机、G1311C二元高压梯度泵、G1315D二极管阵列检测器（美国安捷伦公司）；Unitary C₁₈色谱柱（华谱新创科技有限公司）；AE240型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ5200DE型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；冷冻离心机（HERMLE 2323K，德国）；DHG—9246A型电热恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

甲醇（色谱纯）、十二烷基磺酸钠（分析纯）、磷酸（分析纯）、乙腈（色谱纯）、水为Milli-Q超纯水。

盐酸小檗碱对照品（批号110713-201212，质量分数86.7 %），购自中国食品药品检定研究院；盐酸黄柏碱对照品（批号111895-201303，质量分数95.8%）购自上海同田生物技术有限公司。

2012年7月、10月和2013年1月、3月采收9种不同树龄（1、2、3、4、5、10、15、20、25年）新鲜黄皮树的根皮、茎皮，切块。

2012年7月和2012年10月2个月份采收的9种不同树龄新鲜黄皮树的根（木质部）的切块。

2012年10月和2013年1月2个月份1年和2年生黄皮树茎（木质部），切块。

样品来自湘西花垣县道二乡，均由湖南湘泉药业股份有限公司提供。所有样品经湖南中医药大学杨广民教授鉴定为芸香科植物黄皮树Phellodendronchinense Schneid.。

精密称取盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱对照品用适量甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，配制成181.4 μg/mL的盐酸小檗碱和107.5 μg/mL的盐酸黄柏碱对照品溶液。

精密称取样品粉末0.5 g，置于150 mL的具塞锥形瓶中，加入1%醋酸-甲醇50 mL，称定质量，超声提取（超声温度为35 ℃，功率为250 W、40 kHz）30 min，放冷至室温，再称定质量，用1%醋酸-甲醇补足减少的质量，10 000 r/min离心10 min，取上清液用0.45 μm的有机滤膜滤过，即得。

采用Unitary C₁₈柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）同时测定样品中小檗碱和黄柏碱。体积流量0.25 mL/min；流动相乙腈-0.1%磷酸溶液（每100毫升加十二烷基磺酸钠0.2 g），梯度洗脱（0～15 min，70%～40% A；15～17 min，40%～10% A；17～19 min，10%～70% A）；检测波长：小檗碱365 nm、黄柏碱284 nm；柱温25 ℃；进样量5 μL。在此条件下，样品中黄柏碱和小檗碱与相邻成分达到良好基线分离，见图 1。

图 1 对照品和样品HPLC色谱 Fig. 1 HPLC of reference substance and sample

分别精确量取盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱对照品溶液1.5、2、3、4、5、6 μL，用HPLC检测，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，回归方程分别为盐酸小檗碱：Y＝76 078 X＋1 575，r＝0.999 4；盐酸黄柏碱：Y＝28 081 X＋6，r＝0.999 7，盐酸小檗碱在0.132～0.254 mg/mL，盐酸黄柏碱在0.046～0.152 mg/mL呈良好线性关系。

取适量小檗碱、黄柏碱对照品溶液，在上述色谱条件下，重复进样6次，测得小檗碱、黄柏碱峰面积，计算RSD分别为0.15%、0.64%。结果表明，该方法精密度良好。

取同一供试品溶液2μL，分别在0、2、4、8、16、24 h按上述色谱条件测定，测得小檗碱、黄柏碱峰面积，RSD分别为0.04%、0.22%，结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。

精密称取2年生黄皮树茎皮粉末6份，每份0.5 g，平行制备供试品溶液，在色谱条件下分析测定。

计算RSD分别为1.50%、1.80%，表明测定方法重复性良好。

精密称取已测定黄柏碱和小檗碱的样品粉末6份，加1%醋酸-甲醇溶液溶液50 mL超声提取，所得溶液用HPLC检测，测得小檗碱、黄柏碱平均回收率分别为96.90%、104.1%；RSD为1.75%、1.89%。

取样品根皮、茎皮各36份，取样量均为1 g，进行样品处理和测定，测得根皮、茎皮两部位中小檗碱和黄柏碱的量见表 1～4。

表 1(Table 1)

表 1 4个月份采收的9种树龄黄皮树茎皮中小檗碱的质量分数 Table 1 Contents of berberine in stem barks of P. chinense of nine tree ages from four months 采收月份 小檗碱质量分数 / % 1年 2年 3年 4年 5年 10年 15年 20年 25年 1月 0.88 1.74 4.67 4.76 4.79 4.80 5.06 5.18 5.49 3月 0.91 1.77 4.69 4.81 4.83 4.82 5.22 5.33 5.79 7月 0.82 1.74 4.59 4.62 4.76 4.76 4.93 5.09 5.48 10月 0.96 1.78 4.73 4.88 4.93 4.96 5.28 5.72 5.94 平均值 0.89 1.76 4.67 4.77 4.83 4.84 5.12 5.33 5.68

表 1 4个月份采收的9种树龄黄皮树茎皮中小檗碱的质量分数 Table 1 Contents of berberine in stem barks of P. chinense of nine tree ages from four months

表 2(Table 2)

表 2 4个月份采收的9种树龄黄皮树根皮中小檗碱的质量分数 Table 2 Contents of berberine in root barks of P. chinense of nine tree ages from four months 采收月份 小檗碱质量分数 / % 1年 2年 3年 4年 5年 10年 15年 20年 25年 1月 1.31 2.31 4.71 5.32 5.55 6.58 6.66 7.05 7.28 3月 1.37 2.36 4.96 5.67 5.85 6.66 6.79 7.08 7.34 7月 1.00 2.07 4.69 5.07 5.12 6.31 6.36 6.53 6.58 10月 1.46 2.57 5.48 6.17 6.33 6.87 7.12 7.74 7.90 平均值 1.29 2.33 4.96 5.56 5.71 6.61 6.98 7.10 7.28

表 2 4个月份采收的9种树龄黄皮树根皮中小檗碱的质量分数 Table 2 Contents of berberine in root barks of P. chinense of nine tree ages from four months

表 3(Table 3)

表 3 4个月份采收的9种树龄黄皮树茎皮中黄柏碱的质量分数 Table 3 Contents of phellodendrine in stem barks of P. chinense of nine tree ages in four months 采收月份 黄柏碱质量分数 / % 1年 2年 3年 4年 5年 10年 15年 20年 25年 1月 0.12 0.17 0.25 0.29 0.33 0.35 0.36 0.36 0.43 3月 0.13 0.18 0.25 0.31 0.36 0.45 0.47 0.49 0.51 7月 0.11 0.12 0.22 0.24 0.29 0.31 0.32 0.35 0.39 10月 0.14 0.20 0.35 0.36 0.41 0.47 0.49 0.51 0.59 平均值 0.13 0.17 0.27 0.30 0.35 0.40 0.41 0.43 0.48

表 3 4个月份采收的9种树龄黄皮树茎皮中黄柏碱的质量分数 Table 3 Contents of phellodendrine in stem barks of P. chinense of nine tree ages in four months

表 4(Table 4)

表 4 4个月份采收的9种树龄黄皮树根皮中黄柏碱的质量分数 Table 4 Contents of phellodendrine in root barks of P. chinense of nine tree ages in four months 采收月份 黄柏碱质量分数 / % 1年 2年 3年 4年 5年 10年 15年 20年 25年 1月 0.19 0.20 0.45 0.63 0.60 0.67 0.69 0.80 0.85 3月 0.21 0.22 0.52 0.66 0.68 0.70 0.74 0.85 1.05 7月 0.14 0.17 0.37 0.38 0.45 0.51 0.60 0.64 0.78 10月 0.24 0.30 0.54 0.71 0.74 0.81 0.83 0.89 1.29 平均值 0.20 0.22 0.47 0.60 0.62 0.67 0.72 0.80 0.99

表 4 4个月份采收的9种树龄黄皮树根皮中黄柏碱的质量分数 Table 4 Contents of phellodendrine in root barks of P. chinense of nine tree ages in four months

由表 1～4中数据分析，黄皮树中黄柏碱和小檗碱的量最高的部位是根皮，其根皮中黄柏碱与小檗碱质量分数的平均值分别为0.59%、5.31%；茎皮略低，为0.33%、4.21%。

根皮与茎皮的小檗碱积累在第3年达到接近5%，可考虑用“幼龄黄柏”即生长年限在3年左右的黄皮树茎皮，通过大规模密植解决因生长年限过长的资源需求和短时期追求种植效益的现实问题，采收地上部分后还可在3年后继续采收茎皮。从表 1～4数据来看，根皮、茎皮的差异不大，开发“幼龄黄柏”的可能性较大。

由表 1～4数据分析，4个不同月份采收的黄柏中小檗碱、黄柏碱量有所不同，但有一定规律。10月采收的黄柏中小檗碱、黄柏碱量均高于其他月份，7月采收的黄柏中生物碱累积量最低。因此，证实传统秋季采收的合理性。

取黄皮树根（木质部）共18份样品，取样量均为1 g，进行样品处理和测定，测得根（木质部）中小檗碱和黄柏碱的量，结果见表 5和6，9种不同树龄黄皮树的根（木质部）中黄柏碱和小檗碱的量，最后取平均值，分别为0.04%、0.42%。

表 5(Table 5)

表 5 2个月份采收的9种树龄黄皮树根（木质部）中小檗碱的质量分数 Table 5 Contents of berberine in roots of P. chinense of nine tree ages in two months 采收月份 小檗碱质量分数 / % 1年 2年 3年 4年 5年 10年 15年 20年 25年 7月 0.02 0.10 0.16 0.35 0.39 0.42 0.51 0.59 0.84 10月 0.03 0.13 0.32 0.39 0.41 0.48 0.72 0.83 0.92 平均值 0.03 0.12 0.24 0.37 0.40 0.45 0.62 0.71 0.88

表 5 2个月份采收的9种树龄黄皮树根（木质部）中小檗碱的质量分数 Table 5 Contents of berberine in roots of P. chinense of nine tree ages in two months

表 6(Table 6)

表 6 2个月份采收的9种树龄黄皮树根（木质部）中黄柏碱的质量分数 Table 6 Contents of phellodendrine in roots of P. chinense of nine years in two months 采收月份 黄柏碱质量分数 / % 1年 2年 3年 4年 5年 10年 15年 20年 25年 7月 0.01 0.01 0.02 0.02 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 10月 0.02 0.02 0.03 0.04 0.04 0.05 0.06 0.07 0.09 平均值 0.015 0.015 0.025 0.03 0.03 0.04 0.05 0.06 0.075

表 6 2个月份采收的9种树龄黄皮树根（木质部）中黄柏碱的质量分数 Table 6 Contents of phellodendrine in roots of P. chinense of nine years in two months

取黄皮树茎（木质部）共4份样品，取样量均为1 g，进行样品处理和测定，测得茎（木质部）中小檗碱和黄柏碱的量，见表 7和8。

表 7(Table 7)

表 7 黄皮树茎（木质部）中小檗碱的质量分数 Table 7 Contents of berberine in stems of P. chinense 采收月份 小檗碱质量分数 / % 1年 2年 1月 0.02 0.08 10月 0.03 0.10 平均值 0.025 0.09

表 7 黄皮树茎（木质部）中小檗碱的质量分数 Table 7 Contents of berberine in stems of P. chinense

表 8(Table 8)

表 8 黄皮树茎（木质部）中黄柏碱的质量分数 Table 8 Contents of phellodendrine in stems of P. chinense 采收月份 黄柏碱质量分数 / % 1年 2年 1月 0.01 0.01 10月 0.01 0.02 平均值 0.01 0.015

表 8 黄皮树茎（木质部）中黄柏碱的质量分数 Table 8 Contents of phellodendrine in stems of P. chinense

从表中数据可看出，在秋（10月）、冬（1月）两季采收的1年生、2年生黄皮树茎（木质部）样品中，由于黄柏碱含量较低，其增长量不大，其中1月采收1年生与2年生黄皮树茎（木质部）中黄柏碱质量分数均为0.1%，未见增长；但小檗碱增长速率可观，1月与10月采收的黄皮树茎（木质部），2年生相比1年生样品中小檗碱质量分数分别增长3倍和2.3倍。

比较茎皮、根皮和根（木质部）中小檗碱和黄柏碱量，根皮中小檗碱和黄柏碱量高一些，但生物量相对小得多。根（木质部）远远低于茎皮、根皮中生物碱累积量，且样品中树龄最高（25年）的黄柏根（木质部）中小檗碱量也仅为0.88%。

本研究以黄柏碱、小檗碱为指标成分，研究产地为湖南吉首的不同生长年限的黄皮树中黄柏碱与小檗碱在不同树龄、不同季节、不同生长部位中的代谢累积变化规律，采用HPLC法测定其小檗碱和黄柏碱量进行数据比较，结果显示小檗碱和黄柏碱的量逐年变化，前3年的量变化趋势大，随后小檗碱和黄柏碱量增幅趋势减缓；在黄皮树不同采收部位中，小檗碱和黄柏碱的累积顺序为根皮＞茎皮＞根；此外，比较同一树龄1、3、7、10月采收的黄皮树中小檗碱和黄柏碱量，10月采收的黄皮树中小檗碱和黄柏碱量略高。本实验室曾做过“幼龄厚朴”研究工作，显示厚朴根皮的厚朴酚累积量远远大于茎皮，可以尝试通过密植的方法得到原料^[7]。但黄皮树根皮与茎皮的量相差不大，证明地上部分茎皮可用于开发，地下根可用于再生。

因此，本实验还将密植黄皮树（3年生）的茎皮年均亩产量与野生黄皮树（15年生）茎皮年均每公顷产量进行了比较。采收的15年生黄皮树10株，株间距为1.8 m×2.5 m，每公顷约种植2 100株。剥取其新鲜茎皮称量，阴干处理，平均单株茎皮7 kg，茎皮小檗碱量为5.12%，每公顷产茎皮14 700 kg，年均每公顷产茎皮975 kg，每公顷产小檗碱为750 kg，年均每公顷产小檗碱为49.5 kg。

另外采收种植3年的黄皮树10株，株间距为0.5 m×0.6 m，每公顷约种植33 000株。剥取其新鲜茎皮称量，阴干处理，平均单株茎皮57 g，茎皮小檗碱量为4.69%，每公顷产茎皮1 875 kg，年均每公顷产茎皮630 kg，每公顷产小檗碱为88.5 kg，年均每公顷产小檗碱为30 kg。

若要提高小檗碱每公顷产量，可改变3年生黄皮树的种植密度，以下是2种种植方案。

3年生黄皮树种植方案一：株间距为0.4 m×0.5 m，每公顷约种植49 500株。理论上，其单株茎皮量以及茎皮小檗碱量应与按株间距0.5 m×0.6 m种植所得的黄皮树单株茎皮量大致相当。若采用该种种植方案，故可推算出其每公顷产茎皮应该可达2820 kg，年均每公顷产茎皮约945 kg，每公顷产小檗碱约195 kg，年均每公顷产小檗碱约64.5 kg。

3年生黄皮树种植方案二：株间距为0.15 m×0.6 m，每公顷约种植111 000株。选择该种株间距种植方法，能使树枝、树叶朝间距宽的两边（60 cm垄距）生长，从而减少行间生长，该方法能在保证树木正常生长需要的同时尽可能将每行中的树木密植。若采用该种种植方案所得的黄皮树单株茎皮量和茎皮小檗碱量与上述数据偏差仍不大，那么，理论上该种高密植的3年生黄皮树每公顷产茎皮量可达6 300 kg，年均每公顷产茎皮2 100 kg，每公顷产小檗碱应该可达270 kg，年均每公顷产小檗碱约90 kg。

进行科学田间管理、优化施肥方案都能增加黄皮树茎皮产量，且采用增皮素^[8]也能促进茎皮生长量。另外，单采的野生3年黄皮树，其中有高达每株0.11 kg干茎皮，小檗碱质量分数为4.73%，由此也间接说明密植黄皮树其3年茎皮的小檗碱量还有提升空间。采用该方法密植幼龄黄柏从其茎皮中获取小檗碱，将使所需种植周期大大缩短，时间和资金上投入也远远小于传统种植方法。该方法土地利用率高，收效快，单位面积小檗碱年产量高，黄柏原料小檗碱量高，投资见效快，农民种植积极性高，有利于规模化、标准化生产黄柏药材的特点，极具应用、推广价值。若方案二能得以实施，将能带来较以往传统种植方法更大的经济效益，“幼龄黄柏”开发前景可观。

本实验总结的小檗碱和黄柏碱代谢累积规律，为黄柏药材采收及资源的可持续利用提供了依据。湘西州属中亚热带山区季风湿润气候，地理位置及气候环境适应黄皮树的生长。黄柏是我国常用大宗中药材，也是湖南特色中药材，利用湘西特色中药材资源，抓住机遇，发挥优势，发展生物医药特色优势产业，将带动农民种植黄皮树的积极性，具有重大的直接经济利益。