镁离子（Mg²⁺）是高等植物必需的矿质元素之一，也是植物细胞中最为丰富的二价阳离子，在植物生长发育中发挥极其重要的作用^[1]。研究表明，Mg²⁺可作为多种酶的激活剂参与植物多种生理生化代谢途径，在维持细胞渗透势、质膜和核酸稳定性，调节核糖体合成、光合作用和逆境胁迫，以及调控有机物在韧皮部装载等过程起关键作用^{[1, 2]}。因此，Mg²⁺在胞内外的转运特性是影响生物学功能的重要载体。目前，在细菌、真菌、动物以及高等植物中，共发现5大类镁离子转运蛋白（magnesiumion transporter，MGT）家族：CorA家族、Mg²⁺/H⁺交换体、离子通道、P型磷酸酶和MgtE基因家族^{[3, 4]}。其中，CorA家族是所有生物体普遍存在的一类主要镁离子转运蛋白家族。该类蛋白N端具有一较大的酸性周质区，C端有两个疏水跨膜域，近C端存在高度保守的Mg²⁺转运所必需的GMN（Gly-Met-Asn）基序^[4]。晶体结构显示CorA家族镁离子转运体是滤斗状的同源五聚体，且每个单体含有2个跨膜区^[5]，有利于Mg²⁺的识别与转运。

高等植物镁离子转运蛋白包含Mg²⁺/H⁺交换体和CorA家族两大类。AtMHX是早期鉴定的定位于液泡膜上的Mg²⁺/H⁺交换体基因^[6]。Li等^[7]早期利用功能克隆技术从拟南芥中鉴定了首个CorA家族镁离子转运蛋白新成员AtMGT1。现在已报道拟南芥和水稻分别有10和9个MGTs基因，苜蓿、大豆等其他植物也存在大量MGTs基因^{[8, 9]}。AtMGTs研究较为清楚，依据基因结构及进化关系可划分为5个类群^[9]，编码蛋白定位于质膜、线粒体、叶绿体以及液泡膜等不同细胞器上^[10]，通过调节叶绿素代谢^[11]、控制花粉发育^[12]、纠正RNA自我剪接^[13]、抗铝离子^{[14, 15]}及镉离子^[16]毒害等多种途径参与对高等植物生长发育的重要调控。

铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo为兰科（Orchidaceae）石斛属Dendrobium Sw. 多年生草本植物，药用部位为新鲜或干燥茎，具有益胃生津、滋阴清热、润肺止咳、明目强身等功效^[17]。现代药理学研究表明，铁皮石斛的多糖、生物碱、氨基酸等成分具有提高免疫功能、抗氧化、抑制肿瘤和降低血糖等功效^[18]。为解析兰科菌根互作的分子机制，课题组前期利用SSH技术富集真菌侵染铁皮石斛根的差异表达基因^[19]，分离得到一条558 bp的EST，BLASTx分析显示其与水稻MRS2-F（GenBank注册号Q8L4S2）相似性较高（67%）。鉴于MGTs基因在植物细胞生理代谢中的重要作用，该差异基因可能在铁皮石斛生长发育中起作用。本研究利用RT-PCR和RACE技术从铁皮石斛分离到一个MGT基因cDNA全长DoMGT1，并进行生物信息学及表达模式分析，为进一步研究其生物学功能提供理论依据。

样品采自云南西双版纳，经笔者鉴定为野生铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo，取根、茎、叶投入液氮中速冻后置-80 ℃保存备用。

按照EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒（Aidlab，中国）操作说明提取总RNA，NanoDrop^TM 2000分光光度计（Thermo Fisher，美国）测定RNA质量和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测完整性。使用M-MLV Reverse Transcriptase kit（Promega，美国）将RNA反转录合成cDNA的第一链，-20 ℃保存备用。

根据原EST序列，设计2条基因特异引物，按照SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit（Clotech，日本）说明书进行2次巢式5’-RACE。5’-RACE引物为DoMGT1-R1（5’-GCCTCCT- ACGGTTCCATAGGTGGTTTC-3’）和DoMGT1-R2（5’-TGTGAGGACAAGAGTTGCCATGCTG-3’）。DoMGT1-R1与UPM引物组合，试剂盒中Program 1程序进行第一轮5’-RACE。反应体系为2.0 μL 10×Advantage^® 2 PCR 缓冲液，0.4 μL 10 mmol/L dNTPs，0.4 μL 10 μmol/L DoMGT1-R1/UPM，0.5 μL 5’-RACE ready cDNA，0.4 μL 5 U/μL 50×Advatange^®2 Polymerase Mix，补ddH₂O至20 μL。反应结束后，取1.0 μL产物作为模板，以DoMGT1-R1与UPM引物组合，进行第2轮巢式5’-RACE。PCR程序为94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 32个循环；72 ℃ 7 min，4 ℃保温。PCR产物经电泳分析，回收目的条带、克隆并测序，与原序列拼接分析后，设计跨ORF引物ORF-F（5’-TAGCGGAATTCAAGATGCGGTCG-3’）和ORF-R（5’-CTGCTAGCAGGGGTTTAAATAAGC3’），进行全长基因的RT-PCR验证。PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的条带、克隆并测序。

使用一系列网络在线工具进行DoMGT1基因核酸及编码蛋白的生物信息学序列分析。利用NCBI的BLASTx（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast/ ）和ORF Finder（http://www.ncbi.nlh.nih.gov/gorf/gorf.htmL ）分析cDNA序列；用ExPASy Proteomics Server的InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/iprscan/ ）和PROSITE SCAN（http://npsa- pbil.ibcp.fr/cgi-bin/-npsa_automat.pl?page＝/NPSA/-npsa_ proscan.html）分析DoMGT1蛋白质的结构域和基元；Protparam（http://web.expasy.org/protparam/ ）和SOPMA（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi- bin/secpred_sopma.pl）分析蛋白质理化性质和二级结构；利用SignalP 4.0（ http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ ）进行分泌蛋白预测；用TMpred（http://www.ch. embnet.org/software/TMPRED_form.html ）预测蛋白跨膜域。PSORT（http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form.html ）进行蛋白质亚细胞定位分析。用DNASTAR 6.0和MEGA 4.0分别进行DoMGT1蛋白的氨基酸序列比对和进化树构建。

分别用2μg根、茎、叶样品总RNA反转录合成cDNA，EFla作为内参基因^[19]，qRT-PCR分析DoMGT1基因的组织表达模式。引物为DoMGT1-qRT-PCR-F（5’-TAT CATACCCATCCAC-CATCCT-3’）和DoMGT1-qRT-PCR-R（5’-ATTGA-TTCATAACTTG GGACAGC-3’）的扩增产物长247 bp。用ABI PRISM 7500实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems，美国）进行扩增。反应体系25 μL包括2×SYBRR^® Premix Ex Taq^TM Master Mix（Takara，中国）12.5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）0.5 μL，ROX 0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH₂O 9 μL。每个反应重复3次，包括不加模板的对照，实验重复3次。PCR程序为95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s，40个循环，反应结束绘制熔解曲线。根据ABI PRISM 7500 SDS软件（Applied Biosystems，美国）生成的循环阈值（Cycle threshold，C_t），用2^-ΔΔCt法^[21]计算相对表达量。

经过两轮5’-RACE反应，克隆、测序获得1 310 bp的序列，与原序列拼接得到1条1 625 bp的cDNA。BLASTx分析表明其与GenBank中已注册的多种植物MGTs基因有较高的相似性（46%～63%），定名为DoMGT1，提交GenBank获得注册号KJ995532。DoMGT1基因的开放阅读框（open reading frame，ORF）长1 278 bp，5’-UTR长93 bp，3’-UTR长234 bp，含有真核生物特有的ployA尾巴结构；起始密码子附近碱基序列GCAATGG遵循KOZAK规则，即A/GNNATGG^[22]。用DoMGT1-ORF-F/R引物进行PCR扩增，获得长1 400 bp的单一条带（图 1），克隆、测序分析显示其含有完整的ORF，与拼接序列一致，说明已成功获得DoMGT1基因的全长cDNA。

图 1 铁皮石斛DoMGT1基因全长cDNA克隆Fig. 1 Cloneof the full length cDNA of DoMGT1 gene in D. officinale

Protparam 预测DoMGT1基因编码的蛋白质分子式为C₂₀₈₆H₃₃₅₈N₅₆₂O₆₅₇S₁₈，包含425个氨基酸残基，等电点4.79，相对分子质量为47 400；DoMGT1蛋白带正电残基（Arg＋Lys）为41，负电残基（Asp＋Glu）为62。该蛋白不稳定系数为44.76，脂肪系数为98.40，亲水性系数为-0.168。SOPMA分析表明，DoMGT1蛋白二级结构主要由α螺旋（52.24%）、随机卷曲（36%）、少量的延伸链（8.24%）和β转角（3.53%）组成。

InterProscan分析结果显示，DoMGT1蛋白含有CorA家族镁离子转运蛋白保守结构域（第313～420位氨基酸）以及MRS2/LPE10保守域（27～420），具备已报道植物MGT的典型结构特征。PROSITE SCAN分析表明，DoMGT1蛋白含有数目不等的基元，包括2个糖基化位点（301～304、382～385）、1个cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点（28～31）、5个蛋白激酶C磷酸化位点（157～159、212～214、234～236、260～262、332～334）、8个酪蛋白激酶II（99～102、134～137、139～142、141～144，162～165、273～276、293～296、332～335）、4个N-豆蔻酰化位点（359～364、372～377、380～385、402～407）、2个酰胺化位点（25～28、417～420）、1个亮氨酸拉链（348～369）等。SignalP 4.0分析DoMGT1不含信号肽，TMpred分析蛋白C末端具有2个跨膜结构（366～383、401～420），符合CorA家族镁离子转运蛋白跨膜域特征。PSORT预测DoMGT1蛋白定位在质膜上的可能性最高为60%，定位于高尔基体、内质网、微体的可能性分别为40%、30%、30%。

运用DNASTAR 6.0中的MegAlign程序对DoMGT1蛋白和4种代表性植物的MGTs基因编码蛋白进行多序列比对分析（图 2）。结果显示，DoMGT1与水稻Oryza sativa Linn. OsMGTE蛋白（Q8S1N1）、蒺藜苜蓿Medicago truncatula Gaertn. （XP_003630373）、番茄Solanum lycopersicum Mill.（XP_004241677）和拟南芥Arabidopsis thaliana(Linn.) Heynh. AtMGT1（NP_565247）一致性分别为52%、48%、48%、43.5%。DoMGT1蛋白近C末端含有GMTs蛋白保守的GMN基序，是镁离子转运所必需的元件^[4]。

图 2 DoMGT1与植物MGTs蛋白的多序列比对Fig. 2 Multiple sequence alignment of DoMGT1 and MGTs proteins from other plants

为分析DoMGT1基因的进化关系，从GenBank数据库中选取来自真菌、高等动物和高等植物中具有代表性的10个物种的34条MGTs蛋白序列，利用MEGA 4.0构建DoMGT1蛋白的系统进化树。图 3结果表明，不同物种MGTs基因的编码蛋白聚成真菌、动物、植物3大类群；DoMGT1与OsMGTD、OsMGTE、OsMGTF聚在一起，共同与AtMGT4构成植物MGTs一大类群。

图 3 DoGMT1基因编码蛋白的分子进化树Fig. 3 A Phylogenetic tree of deduced DoMGT1 protein

分别提取铁皮石斛根、茎、叶等样品总RNA，利用qPCR技术检测DoMGT1基因的组织表达模式。图 4结果表明，DoMGT1基因为组成型表达，相对表达量有明显差异。DoMGT1基因在叶中表达量较高，为根中的3.46倍，茎中次之（1.54倍）。

图 4 利用qPCR分析DoMGT1基因的组织表达模式Fig. 4 Tissue-specific expression pattern of DoMGT1 gene using qPCR analysis

镁离子转运蛋白在植物吸收、转运及维持体内镁离子稳态方面有极其重要的作用^[2]。对拟南芥、水稻等模式植物研究表明，MGTs家族基因成员间协同作用参与调控植物多种生命活动过程^{[8, 9, 15]}。然而，镁离子运输、分配的分子机制尚不清楚，药用植物的相关研究鲜有报道。本研究利用RACE技术首次从珍稀濒危兰科药用铁皮石斛中分离到一个镁离子转运蛋白基因cDNA全长DoMGT1，起始密码子附近序列遵循KOZAK规则^[22]；该基因的编码蛋白含有CorA家族和MRS2/LPE10蛋白的保守结构域。推定的DoMGT1蛋白近C末端存在典型的GMN基序，对蛋白转运Mg²⁺是不可或缺的功能元件^[4]；同时还包含2个跨膜区，印证PSORT关于该蛋白膜定位的预测，这些序列特征与已报道植物MGTs蛋白一致^{[6, 7, 8, 9, 12, 13]}。系统进化分析显示DoMGT1与单子叶植物水稻亲缘关系最近。鉴于植物MGTs的多基因家族特性，而兰科是单子叶植物中最进化的类群，结合DoMGT1基因的生物信息学分析结果，说明DoMGT1系铁皮石斛镁离子转运蛋白基因家族的一个成员。

植物MGTs基因不仅具有组织表达特异性，而且受镉离子、铝离子、低钙或高镁等胁迫因子诱导^{[2, 14, 15]}。拟南芥的10个MGTs基因在角果、花、根、茎和叶等器官中有不同的表达模式，AtMGT5基因仅在花和幼嫩角果特异表达，AtNGT8转录本无法在茎中检测到，其余基因为组成型表达，相对表达量有差异，说明它们通过不同的作用模式参与调控植物生理代谢^[7]。如AtMGT10基因在幼嫩的植株叶片或成熟植株的微管组织中表达，介导叶绿体镁离子的转运而影响叶绿素的代谢^[10]。水稻的9个MGTs基因在未展开的黄绿叶片中低表达，随着叶片成熟表达量增加^[8]。尽管水稻和拟南芥MGTs基因的表达模式差异较大，但该蛋白家族所有成员均能转运镁离子参与植物的生长发育^{[8, 15]}。本研究qPCR分析表明，DoMGT1基因为组成型表达，相对表达量有显著性差异，依次为叶＞茎＞根，说明该基因通过特异的分子表达机制参与植物不同组织的生长发育。DoMGT1基因在石斛叶中的高表达特征，暗示其可能与石斛叶中镁离子转运密切相关，而该基因具体参与的生理过程和调控机制值得深入分析。

目前，植物体镁离子的转运机制研究只是冰山一角，不同植物镁离子转运蛋白家族特性、表达规律和生物学功能等尚无系统研究。镁离子如何被根部吸收、在木质部怎样运输以及在库器官中的卸载和分配等分子机制都不清楚。因此，解析植物MGTs作用机制尚需大量细致的研究工作。开展药用植物MGTs基因克隆与功能分析，将为解析药用植物生理适应机制乃至品质的遗传改良打下基础。本研究的后续工作需要进一步鉴定铁皮石斛DoMGT1和MGTs基因家族其他成员的生物学功能，为珍稀濒危铁皮石斛遗传调控研究和品质改良提供理论依据。