动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）被认为是一种慢性炎症性疾病，其中巨噬细胞源性泡沫细胞的形成是As形成和发展的关键环节之一，主要表现为粥样斑块内巨噬细胞中含有大量的胆固醇酯积聚^[1]。维吾尔民族药物香青兰Dracocephalum moldovica L. 为唇形科青兰属植物，在临床上主要用于治疗冠心病及高血压、心绞痛、As、心肌缺血等疾病^[2]。黄酮类化合物是香青兰的主要化学成分^[3]，现代药理研究表明，香青兰总黄酮具有调血脂、抑制血小板聚集及抑制平滑肌细胞的增生、迁移及黏附分子的表达等抗As作用^{[4, 5]}。本研究通过氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）诱导小鼠腹腔巨噬细胞形成泡沫细胞为实验模型，观察香青兰总黄酮对泡沫细胞形成及细胞内酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶1（ACAT-1）和细胞表面清道夫受体A（SR-A）等分子表达的影响，进一步探讨香青兰总黄酮在治疗As中的可能药效机制。

倒置荧光显微镜（日本Olympus公司），CO₂培养箱（美国Thermo公司），酶标仪（美国Bio-Rad公司），iQ5实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司），流式细胞仪（美国BD公司），荧光分光光度计（日本Hitachi公司）。

香青兰总黄酮（总黄酮质量分数为57%，新疆西部加斯特药业有限公司提供，批号20100708）。细胞细菌总RNA提取试剂盒为天根生化科技（北京）有限公司产品；逆转录试剂盒ReverTra Ace qPCR RT Kit为Toyobo公司产品；荧光定量PCR试剂盒Real Master Mix（EVAGreen^TM）为NewBio公司产品；RPMI 1640培养基为Gibco公司产品；牛血清白蛋白、Ox-LDL、油红O、胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶、辣根过氧化物酶均为Sigma公司产品，兔抗鼠SR-A单克隆抗体为Epitomics公司产品，FITC标记山羊抗兔IgG二抗为武汉博士德生物工程有限公司产品。

SPF级BALB/c小鼠，体质量为18～22 g，由成都达硕生物科技有限公司提供，许可证号SCXK（川）2008-24。

小鼠ip 8%硫乙醇酸盐液1 mL，1次/d，连续3 d。第4天颈椎脱臼法处死小鼠，75%乙醇浸泡10 min，剪开腹部皮肤，暴露出腹膜。将5 mL PBS注入腹腔中，用手揉压腹膜两侧15 min，抽吸出腹腔液体注入离心管中。重复以上操作1次，合并2次液体，4 ℃、l 000 r/min离心10 min。去上清，加入10 mL含10%胎牛血清的无酚红RPMl 1640培养液，混匀后计数细胞，调整为2×10⁶/mL。接种到6孔培养板中，每孔2 mL，置5% CO₂、37 ℃孵箱培养2 h后去上清液，用PBS洗去未贴壁细胞，继续培养3 d后随机分组：对照组（未加任何干预因素）、Ox-LDL组（50 μg/mL）、Ox-LDL（50 μg/mL）＋香青兰总黄酮组（高、中、低剂量分别为100、50、25 μg/mL），各组的最终体积均为2 mL，分组后细胞继续培养48 h后进行以下检测。

培养的巨噬细胞用PBS冲洗3次，每次5 min，2.5%戊二醛固定3 h，2.5%重铬酸钾处理16 h，新鲜配制的1%油红O染色20 min，苏木素染2 min，1% HCl分色及返蓝，各步骤间均用双蒸水冲洗干净。显微镜下观察，细胞内脂质呈红色、细胞核呈蓝色的为泡沫细胞。400倍光镜下非重复计数100个细胞，计算泡沫细胞所占的百分比。

收集各组细胞，PBS洗涤3次，重悬于0.5 mL磷酸钠缓冲液（pH 7.4，0.1 mol/L）中，超声波裂解细胞1 min，取0.1 mL细胞样品加入到0.9 mL胆固醇检测反应液（0.1 U/mL胆固醇氧化酶、1 U/mL过氧化物酶、0.01 U/mL胆固醇酯酶、0.05% Triton X-100、1 mmol/L胆酸钠、0.6 mg/mL对羟基苯乙酸，配制于pH 7.4、0.1 mol/L磷酸钠缓冲液中），37 ℃孵育1 h后，于荧光分光光度计检测其荧光强度，设定激发波长为325 nm，发射波长为415 nm^[9]。以标准胆固醇溶液制作标准曲线，计算出各组细胞中胆固醇浓度。以考马斯亮蓝G-250法测定各组细胞样品中蛋白质的量，细胞内总胆固醇的量用每毫克蛋白所含胆固醇的量表示（μg/mg）。反应液中省去胆固醇酯酶用以检测游离胆固醇，细胞内胆固醇酯的量用总胆固醇与游离胆固醇的差值获得。

mRNA表达

收集各组细胞，按照试剂盒说明操作方法提取总RNA，并进行逆转录反应。参照GenBank中小鼠ACAT-1 mRNA的序列设计引物，上游5’-TGCACGACTGGCTCTACTAC-3’，下游5’-CCG- GGTAGAAGTAACTCAGG-3’。针对目的基因和内参β-actin，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应，并将PCR产物梯度稀释作为标准品，与适当浓度的待测样品 cDNA 2 μL，加入上下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），EVAGreen^TM 10 μL，无菌双蒸水补齐至20 μL，于BIO-RAD IQ5荧光实时定量PCR仪中进行反应。在每个循环结束前系统会自动检测荧光产物的量。为建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后继续从72 ℃缓慢加热到94 ℃，熔解曲线峰值单一性判断扩增特异性。将不同浓度标准品的模板量的对数和相应的C_t值绘制标准曲线，根据标准曲线计算待测样品的拷贝数。以目的基因拷贝数与β-actin基因拷贝数比值计算目的基因mRNA相对表达量。

收集各组细胞，分别加入兔抗鼠SR-A一抗，再加入FITC标记的二抗，采用流式细胞术检测细胞表面SR-A的表达水平。

采用SPSS 17.0统计学软件处理，所有实验数据均用x±s表示，计量均数间的比较采用t检验，比值均数间的比较采用χ²检验。

油红O染色显示，对照组细胞几乎未被油红O染上红色，Ox-LDL组大量细胞胞浆被染成红色，形成典型的泡沫细胞。而香青兰总黄酮对Ox-LDL诱导的泡沫细胞形成具有明显的抑制作用，见图 1。其中，高、中剂量组的抑制作用较为显著（P＜0.05、0.01），低剂量组的抑制作用无显著意义（P＞0.05），总体上呈一定的剂量依赖性，见表 1。

图 1 小鼠腹腔巨噬细胞油红O染色结果Fig. 1 Oil red O staining pictures of peritoneal macrophages of mice

表 1(Table 1)

表 1 香青兰总黄酮对巨噬细胞形成泡沫细胞的影响 Table 1 Effects of total flavonoids from D. moldovica on macrophage foam cell formation 组别 ρ / (μg∙mL-1) 泡沫细胞 / % 对照 — 3.52± 0.85** Ox-LDL — 86.30±11.30 Ox-LDL＋香青兰总黄酮 100 53.50± 8.26** 50 71.50± 7.87 25 83.90± 9.54 与Ox-LDL组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下同 *P < 0.05 **P < 0.01 vs Ox-LDL group,same as below

表 1 香青兰总黄酮对巨噬细胞形成泡沫细胞的影响 Table 1 Effects of total flavonoids from D. moldovica on macrophage foam cell formation

如表 2所示，培养基中添加Ox-LDL后，巨噬细胞能大量吞噬Ox-LDL，细胞内胆固醇酯显著高于对照组（P＜0.01），而各质量浓度的香青兰总黄酮能不同程度地抑制巨噬细胞内胆固醇酯的量。其中，高剂量组和中剂量组抑制作用较为显著（P＜0.05、0.01），低剂量组的抑制作用无显著意义（P＞0.05），总体上呈一定的剂量依赖性。

表 2(Table 2)

表 2 香青兰总黄酮对巨噬细胞内胆固醇酯、ACAT-1 mRNA、表面SR-A表达的影响 Table 2 Effects of total flavonoids from D. moldovica on content of cholesterol ester and expression level of ACAT-1 mRNA in cells and expression level of SR-A on cells 组别 ρ / (μg∙mL-1) 胆固醇酯 / (μg∙mg-1) ACAT-1 mRNA SR-A（平均荧光强度） 对照 — 4.37± 0.64** 0.25±0.03** 5.39±1.34** Ox-LDL — 68.30±11.50 0.76±0.14 28.50±7.07 Ox-LDL＋香青兰总黄酮 100 48.50± 9.47** 0.48±0.15** 16.60±6.12** 50 55.60± 8.26 0.61±0.12 18.90±6.08 25 64.80± 8.12 0.64±0.09 21.50±7.12

表 2 香青兰总黄酮对巨噬细胞内胆固醇酯、ACAT-1 mRNA、表面SR-A表达的影响 Table 2 Effects of total flavonoids from D. moldovica on content of cholesterol ester and expression level of ACAT-1 mRNA in cells and expression level of SR-A on cells

与对照组比较，巨噬细胞在摄取Ox-LDL的过程中，其ACAT-1 mRNA的表达水平明显升高（P＜0.01），而不同剂量的香青兰总黄酮均能不同程度地抑制ACAT-1 mRNA的表达（P＜0.05、0.01），总体上呈一定的剂量依赖性，见表 2。

培养基中添加Ox-LDL后，巨噬细胞表面SR-A的表达水平显著高于对照组（P＜0.01），而香青兰总黄酮能不同程度地抑制细胞表面SR-A的表达。其中高剂量组和中剂量组总黄酮的抑制作用较为显著（P＜0.05、0.01），低剂量组的抑制作用无显著意义（P＞0.05），总体上呈一定的剂量依赖性，见表 2。

氧化损伤学说是As发病机制的一个重要学说，该学说认为机体产生的活性氧分子可引起脂质的氧化损伤。氧化修饰后的低密度脂蛋白（Ox-LDL）可被单核细胞来源的巨噬细胞通过其细胞表面的清道夫受体摄取，这种内吞作用引起胞内脂质过氧化产物的生成，并且促使细胞内胆固醇酯的积聚，最终导致了泡沫细胞的形成^[6]。泡沫细胞在动脉管壁内的聚积可引起脂质条纹病变的发生，是As早期阶段关键环节之一。

香青兰作为新疆地区传统治疗心血管疾病的天然药物，对其药理作用机制的认识仍然不足。本实验通过Ox-LDL诱导建立小鼠腹腔巨噬细胞源性泡沫细胞模型，结果显示，香青兰总黄酮可有效抑制Ox-LDL诱导巨噬细胞内胆固醇酯的积聚，并且显著减弱了巨噬细胞源性泡沫细胞的形成，因此香青兰总黄酮可能通过抑制泡沫细胞的形成来发挥其抗As作用。

清道夫受体是一类主要位于巨噬细胞表面的糖蛋白^[7]，其中与As关系密切的有SR-A，SR-A是介导巨噬细胞摄取Ox-LDL的主要途径^[8]。与LDL受体不同，由SR-A介导的巨噬细胞对Ox-LDL的内吞，不受细胞内胆固醇水平的负反馈调节，使得胞内脂质无限制积聚，造成胞内胆固醇酯的堆积，最终形成泡沫细胞。本实验结果显示，Ox-LDL在诱导小鼠腹腔巨噬细胞形成泡沫细胞过程中，细胞表面SR-A的表达水平显著提高，香青兰总黄酮可显著抑制Ox-LDL的这种作用。因此香青兰总黄酮可能通过抑制SR-A的表达从而减少巨噬细胞对Ox-LDL的摄取，进而抑制泡沫细胞的形成。

ACAT-1是细胞内催化胆固醇与长链脂肪酸酯化形成胆固醇酯的酶，研究表明ACAT-1参与了巨噬细胞内胆固醇酯的积聚和泡沫细胞的形成过程，与As斑块的生成密切相关^[9]。本实验显示，Ox-LDL在诱导小鼠腹腔巨噬细胞形成泡沫细胞过程中，ACAT-1的mRNA表达水平显著增高，香青兰总黄酮可显著抑制ACAT-1的转录水平。因此推测香青兰总黄酮可能通过抑制ACAT-1的表达而减少巨噬细胞内胆固醇酯的积聚。

本研究显示，维吾尔民族药物香青兰总黄酮能够显著抑制小鼠腹腔巨噬细胞对Ox-LDL的摄取，进而抑制泡沫细胞的形成。其机制可能通过抑制细胞表面SR-A分子以及细胞中ACAT-1 mRNA的表达水平有关。本研究为探讨香青兰总黄酮临床治疗As的药效机制提供了实验依据。