注射用益气复脉（冻干）（Yiqi Fumai Injection，YFI）源自生脉饮^[1]，是利用先进的药物提取技术，从红参、麦冬、五味子中提取多种有效成分制成的现代中药复方冻干粉针剂。其功能益气复脉、养阴生津，临床研究表明，YFI对于冠心病心绞痛、冠心病所致心力衰竭具有确切疗效^{[2, 3, 4]}。

YFI中主要有效成分为人参皂苷类和木脂素类^{[5, 6]}，目前，对于其中化学成分的定量分析大多针对人参皂苷类和木脂素类成分分别进行^{[7, 8]}，尚无对2大类成分同时定量的报道。本实验采用UPLC- MS/MS技术^[9]建立同时测定YFI中人参皂苷类（人参皂苷Rb₁、Re、Rg₁、Rc、Rd、Rf、Rg₃、F₂和三七皂苷R₁）和木脂素类（五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素）共13种化合物的分析方法，并应用该方法进行YFI中13种化合物的定量分析，以期为YFI的质量控制提供全面、快速、可靠的方法。

XH—C震动搅拌器，金坛市医疗仪器厂；Waters UPLC-MS/MS系统：Acquity Ultra Performance LC，包括紫外检测器、自动进样器、二元泵、在线脱气机；Quattro Premier XE质谱仪：电喷雾离子源（ESI）和MassLynx V4.1工作站；Zentrifugen Mikro 220R台式冷冻离心机，北京森瑞科仪科技发展有限公司；SB25—12 DTN超声波清洗机，宁波新芝生物科技有限公司；AL204万分之一电子天平和XP6百万分之一天平，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司。

对照品人参皂苷Rb₁（批号110704-201223）、Re（批号110754-201324）、Rg₁（批号110703- 201128）、Rc（批号ABS-00007201-005）、Rd（批号110818-201001）、Rf（批号111719-200502）、Rg₃（批号110804-200402）、F₂（批号111764-200601）及三七皂苷R₁（批号110745-200617）、五味子醇甲（批号110857-200608）、五味子甲素（批号110764- 200408）、五味子乙素（批号110765-200609）、艾司唑仑（批号1219-0102）购自中国食品药品检定研究院；五味子醇乙（批号ASB-00019501-005）购自ChromaDex公司，各对照品质量分数均≥98%；注射用益气复脉（冻干）由天津天士力之骄药业有限公司提供（批号20130508、20130511、20130612、20131002、20140101）；乙腈、甲醇，色谱级，Fisher公司，美国；甲酸，色谱级，天津市光复精细化工研究所；水为娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。

分别精密称取人参皂苷Rb₁、Re、Rg₁、Rc、Rd、Rf、Rg₃、F₂及三七皂苷R₁、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素对照品适量，加甲醇-水（1∶1）溶解并摇匀，配制成含人参皂苷Rb₁、Re、Rg₁、Rc、Rd、Rf、Rg₃、F₂及三七皂苷R₁、五味子醇乙质量浓度均为10 μg/mL，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素质量浓度均为1 μg/mL的混合对照品溶液。

精密称取艾司唑仑对照品适量，加甲醇-乙腈（1∶1）溶液，溶解并摇匀，配制成质量浓度为20 μg/mL的内标溶液。

精密称取YFI 0.45 g至100 mL量瓶中，加水适量，超声使溶解为澄清药液，继续加水定容至刻度，混匀，制成含原药4.5 mg/mL的YFI水溶液，精密吸取上述YFI水溶液100 μL，加入5 μL内标溶液，混匀，离心，取上清液，即得。

色谱柱为Agilent Zorbax XDB C₁₈柱（50 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流动相为含0.1%甲酸的水溶液（A）-含0.1%甲酸的甲醇溶液（B），梯度洗脱：0.01～0.8 min，52% A；0.8～1.0 min，52%～35% A；1.0～3.7 min，35%～5% A；3.7～4.7 min，5% A；4.7～4.71 min，5%～52% A；4.71～8.0 min，52% A；体积流量为0.4 mL/min；柱温为室温；进样量10 μL。

离子源为电喷雾离子源（ESI）；气帘气（CUR）体积流量15 L/min；喷雾电压（IS）5 000 V；脱溶剂温度（TEM）350 ℃；雾化气（GS1）体积流量65 L/min；加热辅助气（GS2）体积流量65 L/min。信号采集方式为多反应监测（MRM），见表 1。MRM离子流图见图 1。

图 1 MRM离子流图Fig. 1 MRM ion current graphs

表 1(Table 1)

表 1 对照品的MRM条件 Table 1 MRM conditions of reference substances 成分 母离子（m/z） 子离子（m/z） 去簇电压 / V 碰撞能 / V 碰撞室出口电压 / V 人参皂苷Rb1 1 131.7 365.2 200 85 18 人参皂苷Re 969.6 789.6 266 63 20 人参皂苷Rg1 823.5 643.5 180 53 16 人参皂苷Rc 1 101.6 789.5 256 77 18 人参皂苷Rd 969.5 789.6 266 67 18 人参皂苷Rf 823.5 365.2 256 69 18 人参皂苷Rg3 807.6 364.9 286 71 20 人参皂苷F2 807.5 627.7 180 53 15 三七皂苷R1 955.7 775.7 200 62 19 五味子醇甲 433.2 384.0 101 27 10 五味子醇乙 417.2 368.2 101 25 8 五味子甲素 417.3 316.2 126 35 16 五味子乙素 401.3 300.2 121 33 16 艾司唑仑 295.0 267.0 90 33 15

表 1 对照品的MRM条件 Table 1 MRM conditions of reference substances

分别精密吸取混合对照品溶液适量，加甲醇-水（1∶1）溶液稀释至不同质量浓度，摇匀，制得系列混合对照品溶液，分别取以上混合对照品溶液100 μL，加入5 μL内标溶液，混匀，离心，取上清液按“2.4”项下色谱与质谱条件进行测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），对照品与内标峰面积比值为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程：人参皂苷Rb₁ Y＝0.030 8 X＋0.004 0，r＝0.999 3；人参皂苷Re Y＝0.007 2 X＋0.000 8，r＝0.999 7；人参皂苷Rg₁ Y＝0.022 8 X＋0.004 6，r＝0.999 7；人参皂苷Rc Y＝0.015 2 X＋0.001 2，r＝0.999 7；人参皂苷Rd Y＝0.021 6 X＋0.001 5，r＝0.999 5；人参皂苷Rf Y＝0.012 6 X＋0.001 4，r＝0.999 6；人参皂苷Rg₃ Y＝0.012 7 X＋0.002 5，r＝0.999 6；人参皂苷F₂ Y＝0.010 2 X＋0.004 4，r＝0.999 4；三七皂苷R₁ Y＝0.015 0 X＋0.002 1，r＝0.999 6；五味子醇甲Y＝0.139 9 X＋0.001 4，r＝0.999 2；五味子醇乙Y＝0.005 8 X＋0.000 1，r＝0.999 4；五味子甲素Y＝1.311 3 X＋0.020 3，r＝0.999 5；五味子乙素Y＝1.091 5 X＋0.004 5，r＝0.999 6；结果表明人参皂苷Rg₁、Rb₁、Rc、Rd、Re、Rf、Rg₃、F₂和三七皂苷R₁、五味子醇乙在0.02～10.00 μg/mL、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素在0.004～1.000 μg/mL线性关系良好。

配制低、中、高3个质量浓度的对照品系列溶液。精密吸取混合对照品溶液，加甲醇-水（1∶1）溶液稀释，配制成分别含人参皂苷Rg₁、Rb₁、Rc、Rd、Re、Rf、Rg₃、F₂和三七皂苷R₁、五味子醇乙系列质量浓度均为0.04、0.2、8 μg/mL，五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素系列质量浓度均为8、40、800 ng/mL的混合对照品系列溶液，取以上混合对照品溶液100 μL，加入5 μL内标溶液，混匀，离心，取上清液按“2.4”项下色谱与质谱条件进行测定，1 d内连续进样6次，计算日内精密度；连续3日进行测定，计算日间精密度。结果13种成分低、中、高3个质量浓度（人参皂苷Rg₁、Rb₁、Rc、Rd、Re、Rf、Rg₃、F₂和三七皂苷R₁、五味子醇乙低、中、高3个质量浓度为0.04、0.2、8.0 μg/mL，五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素低、中、高3个质量浓度为8、40、800 ng/mL）的日内精密度分别为人参皂苷Rb₁（1.86%、1.83%、0.81%）、Re（1.19%、1.37%、0.43%）、Rg₁（0.91%、1.77%、0.43%）、Rc（1.69%、1.62%、1.36%）、Rd（1.43%、1.61%、0.27%）、Rf（1.27%、1.90%、1.77%）、Rg₃（1.92%、1.57%、0.92%）、F₂（2.00%、1.50%、0.88%）、三七皂苷R₁（1.50%、1.48%、0.52%）、五味子醇甲（1.42%、1.15%、0.65%）、五味子醇乙（1.72%、1.62%、0.86%）、五味子甲素（0.83%、1.86%、0.86%）、五味子乙素（0.87%、1.36%、0.76%）。

13种成分低、中、高3个质量浓度（人参皂苷Rg₁、Rb₁、Rc、Rd、Re、Rf、Rg₃、F₂和三七皂苷R₁、五味子醇乙低、中、高3个质量浓度为0.04、0.2、8.0 μg/mL，五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素低、中、高3个质量浓度为8、40、800 ng/mL）的日间精密度分别为人参皂苷Rb₁（1.21%、1.71%、0.71%）、Re（0.74%、1.66%、0.17%）、Rg₁（0.27%、0.85%、0.50%）、Rc（1.32%、1.78%、0.14%）、Rd（1.82%、0.34%、1.04%）、Rf（0.44%、1.59%、0.64%）、Rg₃（1.90%、1.70%、0.29%）、F₂（1.05%、0.51%、0.84%）、三七皂苷R₁（0.66%、1.33%、0.55%）、五味子醇甲（0.46%、1.64%、0.62%）、五味子醇乙（1.83%、1.86%、0.22%）、五味子甲素（0.56%、0.52%、0.59%）、五味子乙素（0.38%、0.56%、0.33）。表明所建立的方法重复性好、准确可靠，可以满足待测物定量测定的要求。

取YFI（批号20130508），按“2.3”项下方法处理后，室温放置，分别于0、2、4、6、8、12 h，按“2.4”项下色谱与质谱条件进行测定，计算对照品与内标峰面积比值，结果人参皂苷Rb₁、Re、Rg₁、Rc、Rd、Rf、Rg₃、F₂与三七皂苷R₁、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面积与内标峰面积比值的RSD分别为1.15%、1.86%、1.53%、1.44%、1.34%、1.78%、1.94%、1.69%、1.59%、1.75%、0.99%、1.89%和1.97%。表明供试品溶液在12 h内稳定。

取YFI（批号20130508）6份，按“2.3”项下方法处理后，按“2.4”项下色谱与质谱条件进行测定，计算对照品与内标峰面积比值，结果人参皂苷Rb₁、Re、Rg₁、Rc、Rd、Rf、Rg₃、F₂和三七皂苷R₁、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面积与内标峰面积比值的RSD分别为1.96%、1.81%、1.50%、1.70%、1.96%、1.76%、1.95%、1.90%、1.74%、1.70%、1.72%、1.95%、1.58%。表明该方法重复性良好。

精密量取6份已测定的YFI（批号20130508）水溶液（含原药4.33 mg/mL）50 μL，加入5 μL内标溶液，分别精密加入一定质量浓度的混合对照品溶液50 μL，其中人参皂苷Rg₁ 7.4 μg/mL、Rb₁ 5.6 μg/mL、Rc 3.0 μg/mL、Rd 1.6 μg/mL、Re 1.2 μg/mL、Rf 1.6 μg/mL、Rg₃ 0.7 μg/mL、F₂ 8 ng/mL、三七皂苷R₁ 0.4 μg/mL、五味子醇乙0.08 μg/mL、五味子醇甲0.6 μg/mL、五味子甲素0.6 μg/mL、五味子乙素0.06 μg/mL，混匀，离心，取上清液，按“2.4”项下条件进行测定，记录峰面积，计算加样回收率。结果13种成分的平均回收率和RSD分别为人参皂苷Rb₁（99.49%、1.49%）、Re（100.28%、1.08%）、Rg₁（99.89%、1.40%）、Rc（100.20%、1.49%）、Rd（99.61%、1.21%）、Rf（99.17%、1.01%）、Rg₃（99.46%、1.45%）、F₂（99.78%、1.10%）、三七皂苷R₁（99.82%、1.63%）、五味子醇甲（100.71%、1.09%）、五味子醇乙（98.85%、1.17%）、五味子甲素（101.08%、0.84%）、五味子乙素（98.28%、1.69%）。表明在实验选择的样品处理、色谱与质谱条件下，待测物的提取回收率符合测定要求。

取5个批次YFI，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.4”项下色谱和质谱条件进行测定，分别计算样品中13个成分的质量分数，结果见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 不同批次YFI中13种成分的定量测定结果 Table 2 Quantitative determination of 13 components in YFI from different batches 批号 质量分数 / (μg∙g-1) 人参皂苷Rb1 人参皂苷Re 人参皂苷Rg1 人参皂苷Rc 人参皂苷Rd 人参皂苷Rf 人参皂苷Rg3 20130508 1 294.6±119.9 270.8±25.4 171.6±11.9 680.0±54.7 406.9±62.5 380.0±30.0 166.8±19.3 20130511 1 303.1± 61.5 313.8±30.2 185.2± 3.7 683.1±49.3 462.3±64.9 405.4±10.4 155.8± 5.9 20130612 1 281.5± 89.6 283.1±14.8 163.3±10.5 698.5±60.2 445.4±23.4 370.0±15.4 168.5± 8.5 20131002 1 280.0± 71.7 273.8±12.7 167.8±11.6 701.5±43.1 443.8±40.4 375.4±21.4 163.1± 9.6 20140101 1 249.2± 51.6 290.8±16.6 185.0± 4.5 680.0±17.9 426.9±28.0 367.7±11.6 167.5±27.1 批号 质量分数 / (μg∙g-1) 人参皂苷F2 三七皂苷R1 五味子醇甲 五味子醇乙 五味子甲素 五味子乙素 20130508 1.70±0.04 96.2±7.2 138.5±11.0 20.8±0.4 0.030±0.002 0.003±0.002 0 20130511 2.10±0.10 113.8±5.4 141.0± 5.5 18.3±0.3 0.026±0.001 0.002±0.001 0 20130612 1.90±0.10 91.7±7.6 143.6± 5.0 17.8±0.8 0.027±0.003 0.001±0.001 0 20131002 2.00±0.20 94.3±7.3 140.3± 3.0 18.2±1.0 0.029±0.001 0.001±0.000 4 20140101 1.90±0.10 111.7±5.3 140.8± 5.8 19.6±1.3 0.028±0.002 0.001±0.001 0

表 2 不同批次YFI中13种成分的定量测定结果 Table 2 Quantitative determination of 13 components in YFI from different batches

由于YFI君药红参中质量分数较高的人参皂苷类成分极性较大，因此选择ESI源为其定量分析的离子源。有文献报道人参皂苷在负离子模式下检测比在正离子模式下检测灵敏度更高^{[9, 10, 11]}，本实验考察了正、负离子扫描方式下待测物的响应强度，并进行比较，发现正离子模式下 [M＋Na]⁺ 的响应度更高，且得到的碎片离子更为稳定，因此选择正离子模式进行MS/MS检测。本研究根据优选得到的母离子和碎片离子信息，组建多个MRM离子对，最终确定最合适的MRM条件，提高了选择性，且大幅缩短了检测时间。在流动相中添加甲酸可以提高ESI电离源正离子检测方式下的质谱响应，有利于改善峰形，通过实验研究，最终确定含0.1%甲酸的水溶液-含0.1%甲酸的甲醇溶液作为流动相。

本实验考察不同类型的色谱柱，最终选择Agilent Zorbax XDB C₁₈柱（50 mm×2.1 mm，3.5 μm），其保留时间适中，具有较好的分离效能，不易受到干扰。选用艾司唑仑为内标，其保留时间适当，峰形良好，回收率均符合规定，且在实验过程中稳定可靠。

本实验建立的同时定量分析YFI中人参皂苷类和木脂素类成分的UPLC-MS/MS方法，在13种成分各自的质量浓度范围内，线性良好，所有测定样品的准确度、精密度、回收率、稳定性等均满足定量分析要求，并对YFI 5批次样品进行了多成分定量分析，结果表明所建立的方法快速、准确、可靠，为YFI的质量控制提供了一定的参考。