中草药  2014, Vol. 45 Issue (23): 3383-3386
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引用本文doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.23.005
邵霞, 林家红, 张丽. 甘遂的化学成分及其活性研究[J]. 中草药, 2014, 45(23): 3383-3386.
SHAO Xia, LIN Jia-hong, ZHANG Li. Chemical constituents in root tubers of Euphorbia kansui and their activities[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2014, 45(23): 3383-3386.
甘遂的化学成分及其活性研究
邵霞1, 林家红2, 张丽1     
1. 南京中医药大学 江苏省方剂研究重点实验室, 江苏 南京 210046;
2. 南京恒通医药开发有限公司, 江苏 南京 210046
收稿日期: 2014-7-10;
基金项目： 国家自然科学基金项目(30973940,81373972);江苏政府留学奖学金资助(JS-2009-061);江苏高校优势学科建设工程资助项目(YSXK-2010)
作者简介：邵霞, 实验师, 研究方向为中药炮制.Tel:13913030149 E-mail:shaoxia_1999@163.com
通讯作者：张 丽(1971-), 教授, 硕士生导师, 研究方向为中药炮制与质量控制.Tel:(025)85811519 E-mail:zhangli@ njutcm.edu.cn
摘要：目的 对甘遂Euphorbia kansui毒性部位的化学成分进行提取分离和鉴定;并对化合物进行细胞毒活性筛选.方法 通过硅胶柱色谱、制备型高效液相色谱等方法进行分离纯化,根据波谱数据分析(MS、1H-NMR、13C-NMR)鉴定化合物结构;通过MTT法对单体化合物进行细胞毒活性测试.结果 从甘遂乙醇提取物的醋酸乙酯部位分离得到9个化合物,分别鉴定为甘遂萜脂B(1)、3-O-(2, 3-二甲基丁酰基)-13-O-十二烷酰基-巨大戟二萜醇(2)、5-O-苯甲酰-20-去氧巨大戟二萜醇(3)、大戟醇(4)、异东莨菪素(5)、腺苷(6)、羟基酪醇(7)、2', 4', 7-三羟基异黄酮(8)、大黄素(9).其中化合物1为假白榄烷型二萜类化合物,2、3为巨大戟烷型二萜类化合物,4为三萜类化合物.结论 化合物6～8为首次从该植物中分离得到的化合物,3和9对肠上皮细胞ICE-6具有较好的抑制作用.
关键词： 甘遂;甘遂萜脂B;5-O-苯甲酰-20-去氧巨大戟二萜醇;大戟醇;腺苷;2', 4', 7-三羟基异黄酮    
Chemical constituents in root tubers of Euphorbia kansui and their activities
SHAO Xia1, LIN Jia-hong2, ZHANG Li1    
1. Jiangsu Provincial Key Laboratory for Traditional Chinese Medicine Formulae Research, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China;
2. Nanjing Jiangsu Hengtong Pharmaceutical Development Co., LTD, Nanjing 210046, China
Abstract: Objective To study the isolation and identification of the chemical constituents in the root tubers of Euphorbia kansui and screen the cytotoxic activity of monomer compounds. Methods The silica gel column chromatography and high performance liquid chromatography (HPLC) methodx were used. The structures were identified by the spectrum data analysis (MS, 1H-NMR, and 13C-NMR); The cytotoxic activity of monomer compounds was determined by MTT method. Results Nine compounds were identified from the ethyl acetate part, respectively. They were kansuinin B (1), 3-O-(2, 3-dimethylbutanoyl)-13-O-dodecanoyl-ingenol (2), 5-O-benzoyl-20-deoxyingenol (3), euphol (4), isoscopletin (5), adenosine (6), hydroxytyrosol (7), 2', 4', 7-trihydroxy isoflavone (8), and emodin (9). Among them compound 1 is jatrophane-type diterpene, compounds 2 and 3 are the ingenane-type diterpenes, compound 4 is triterpene compound. Conclusion Compounds 6－8 are isolated from this plant for the first time. Compounds 1 and 9 have the good inhibition on intestinal epithelial cells ICE-6.
Key words: Euphorbia kansui T. N. Liou ex T. P. Wang;kansuinin B;5-O-benzoyl-20-deoxyingenol;euphol;adenosine;2',4',7-trihydroxy isoflavone    

甘遂为大戟科大戟属植物甘遂Euphorbia kansui T. N. Liou ex T. P. Wang的块根，主产于山西、陕西、河南等地。甘遂性寒，味苦，有毒，归肺、肾、大肠经，具有泻水逐饮的功能，在临床上多用于肝硬化腹水、胸腔积液、水肿、咳喘、肿瘤等病症。主要化学成分为二萜、三萜及甾体类化合物，其他成分包括香豆素、脂肪酸、蔗糖、鞣质、树脂等[1]，其中二萜类成分是其主要毒效成分[2, 3]。由斑马鱼毒性评价试验结合文献研究[4, 5]表明甘遂醋酸乙酯部位毒性最强，上述萜类化学成分主要集中在甘遂醋酸乙酯部位，本研究对甘遂的醋酸乙酯部分进行提取分离，共得到9个化合物，分别鉴定为甘遂萜脂B（kansuinin B，1）、3-O-(2,3-二甲基丁酰基)-13-O-十二烷酰基-巨大戟二萜醇 [3-O-(2,3- dimethylbutanoyl)-13-O-dodecanoyl-ingenol，2]、5-O-苯甲酰-20-去氧巨大戟二萜醇（5-benzoyl-20- deoxyingenol，3）、大戟醇（euphol，4）、异东莨菪素（isoscopletin，5）、腺苷（adenosine，6）、羟基酪醇（hydroxytyrosol，7）、2′,4′,7-三羟基异黄酮（2′,4′,7-trihydroxy isoflavone，8）、大黄素（emodin，9）。其中化合物1为假白榄烷型二萜类化合物，2、3为巨大戟烷型二萜类化合物，4为三萜类化合物，化合物6～8为首次从该植物中分离得到的化合物。通过MTT法研究化合物1～4、9对肠上皮细胞ICE-6细胞增殖的影响，结果表明化合物1、9对肠上皮细胞ICE-6增殖表现出了较好的抑制作用。

1 仪器与材料

Bruker ARX500核磁共振仪（瑞士Bruker公司），制备型高效液相色谱仪（Waters 600），NU3000紫外检测器（江苏汉邦科技有限公司），柱色谱硅胶（100～200目）和薄层色谱硅胶G（60型）均为青岛海洋化工厂产品；所用溶剂均为分析纯或色谱纯。

IEC-6细胞购自ATCC公司。甘遂药材购自陕西宝鸡赤沙乡，经南京中医药大学吴启南教授鉴定为大戟科植物甘遂Euphorbia kansui T. N. Liou ex T. P. Wang的干燥块根。

2 提取与分离

取生甘遂药材20 kg打粗粉，加入95%乙醇，50 ℃温浸。每天吸取上清液，减压浓缩，回收得甘遂乙醇提取物浓缩液，加适量硅藻土拌样、过筛，用醋酸乙酯反复萃取，得醋酸乙酯提取物浸膏1.032 kg。取醋酸乙酯浸膏进行硅胶柱色谱，以石油醚-醋酸乙酯（1︰0～0︰2）梯度洗脱，石油醚-醋酸乙酯（100︰1）洗脱流分得混合物，经高效液相制备色谱（甲醇-水80︰20），得化合物1（7 mg）、5（5 mg）、6（6 mg）、7（4 mg）；石油醚-醋酸乙酯（100︰2）洗脱流分得黄色混合物，经高效液相制备色谱（乙腈-水95︰5）得化合物2（5 mg）、3（8 mg）、4（48 mg）；石油醚-醋酸乙酯（100︰3）洗脱流分得棕色混合物，经高效液相制备（甲醇-水60︰40）得化合物8（5 mg）、9（36 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末（氯仿）。1H-NMR (500 MHz,CDCl3) δ: 4.52 (1H,s,H-1),5.43 (1H,d,J = 3.5 Hz,H-3),3.70 (1H,dd,J = 9.6,3.6 Hz,H-4),5.88 (1H,d,J = 9.5 Hz,H-5),5.33 (1H,m,H-7),5.85 (1H,dd,J = 9.5,16.0 Hz,H-8),3.39 (1H,d,J = 3.0 Hz,H-11),2.95 (1H,s,H-12),3.95 (1H,m,H-13),1.30 (3H,s,H-16),6.04 (1H,s,H-17a),6.01 (1H,s,H-17b),1.35 (3H,s,H-18),0.82 (3H,s,H-19),1.39 (3H,d,J = 7.0 Hz,H-20),2.46 (1H,d,J = 16.0 Hz,2-OH),3.36 (1H,d,J = 10.0 Hz,8-OH),4.26 (1H,d,J = 16.0 Hz,15-OH),1.97 (3H,s,3-COMe),2.22 (3H,s,15-COMe); C5上取代苯环：7.64 (4H,m,H-2,6),7.11 (2H,m,H-3,5),7.32 (1H,m,H-4); C7上取代苯环：7.64 (4H,m,H-2,6),7.19 (1H,m,H-4),7.01 (2H,m,H-3,5)；13C-NMR (125 MHz,CDCl3) δ: 87.1 (C-1),78.1 (C-2),76.7 (C-3),45.1 (C-4),73.8 (C-5),135.8 (C-6),64.6 (C-7),72.7 (C-8),209.5 (C-9),48.1 (C-10),60.8 (C-11),59.0(C-12),42.6 (C-13),204.9 (C-14),96.1 (C-15),20.2 (C-16),128.3 (C-17),21.6 (C-18),19.0 (C-19),17.0 (C-20),172.4 (1-CO),21.3 (1-COMe),168.8 (3-CO),20.4 (3-COMe),164.9 (5- CO),166 (7-CO)。以上数据与文献报道一致[6]，故鉴定化合物1为甘遂萜脂B。

化合物2：白色蜡状物（氯仿）。1H-NMR (500 MHz,CDCl3) δ: 6.03 (1H,m,H-7),6.01 (1H,m,H-1),5.44 (1H,s,H-3),4.15 (2H,s,H-20),4.09 (1H,dd,J = 12.0,2.5 Hz,H-8),4.06 (1H,s,H-5),2.72 (1H,dd,J = 16.8,2.8 Hz,H-12a),2.61 (1H,m,H-11),2.20 (1H,m,H-12b),1.78 (3H,s,H-19),1.19 (3H,s,H-17),1.06 (3H,s,H-16),0.97 (3H,d,J = 7.0 Hz,H-18),3位取代基：2.31 (1H,m,H-2′),1.91 (1H,m,H-3′),0.95 (3H,d,J = 7.0 Hz,H-4′ ),0.92 (3H,d,J = 6.5 Hz,3′-CH3),1.14 (3H,d,J = 7.0 Hz,2′-CH3),13位取代基：2.20 (2H,m,H-2′′),1.55 (2H,m,H-3′′),1.25 (16H,s,H-4′′～9′′),0.88 (3H,t,J = 6.8 Hz,H-10′′)。以上数据与文献报道一致[6]，故鉴定化合物2为3-O-(2,3-二甲基丁酰基)-13-O-十二烷酰基巨大戟二萜醇。

化合物3：无色蜡状固体（氯仿）。1H-NMR (500 MHz,CDCl3) δ: 5.99 (1H,d,J = 1.5 Hz,H-1),5.89 (1H,m,H-7),5.40 (1H,s,H-5),4.25 (1H,dd,J = 4.5,14.1 Hz,H-8),3.6 (1H,s,H-3),2.43 (1H,m,H-11),2.34 (1H,ddd,J = 4.8,6.3,15.9 Hz,H-12a),1.82 (3H,d,J = 1.5 Hz,H-19),1.76 (1H,ddd,J = 4.8,6.3,15.9 Hz,H-12b),1.60 (3H,s,H-20),1.17 (3H,s,H-17),1.07 (3H,s,H-16),0.98 (3H,d,J = 6.9 Hz,H-18),0.95 (1H,m,H-14),0.69 (1H,m,H-13),COPh-5依次为8.10 (2H,m),7.59 (2H,m),7.45 (1H,m)。以上数据与文献报道一致[6]，故鉴定化合物3为5-O-苯甲酰-20-去氧巨大戟二萜醇。

化合物4：白色针晶（氯仿）。1H-NMR (300 MHz,CDCl3) δ: 5.09 (1H,m,H-24),3.23 (1H,dd,J = 11.4,4.5 Hz,H-3),1.68 (3H,s,H-26),1.60 (3H,brs,H-27),1.00 (3H,s,H-29),0.95 (3H,s,H-19),0.87 (3H,s,H-28),0.84 (3H,d,J = 6.6 Hz,H-21),0.80 (3H,s,H-18),0.75 (3H,s,H-30)；13C-NMR (150 MHz,CDCl3) δ: 35.3 (C-1),28.0 (C-2),79.1 (C-3),39.0 (C-4),51.0 (C-5),19.0 (C-6),27.8 (C-7),134.1 (C-8),133.6 (C-9),37.4 (C-10),21.7 (C-11),28.2 (C-12),44.2 (C-13),50.1 (C-14),29.9 (C-15),28.3 (C-16),49.7 (C-17),15.7 (C-18),20.3 (C-19),36.0 (C-20),19.0 (C-21),35.5 (C-22),24.8 (C-23),125.3 (C-24),131.0 (C-25),17.8 (C-26),25.9 (C-27),24.6 (C-28),28.2 (C-29),15.7 (C-30)。以上数据与文献报道一致[7]，故鉴定化合物4为大戟醇。

化合物5：无色针晶（氯仿）。1H-NMR (500 MHz,CDCl3) δ: 7.59 (1H,d,J = 9.0 Hz,H-4),6.27 (1H,d,J = 9.0 Hz,H-3),6.92 (1H,s,H-5),6.85 (1H,s,H-8),6.1 (1H,brs,OH),3.95 (3H,s,-OCH3)。以上数据与文献报道一致[8]，故鉴定化合物5为异东莨菪素。

化合物6：无色粉末（氯仿）。1H-NMR (500 MHz,CDCl3) δ: 8.41 (1H,s,H-8),8.25 (1H,s,H-2),6.01 (1H,d,J = 6.0 Hz,H-1′),4.70 (1H,t,J = 5.5 Hz,H-2′),4.33 (1H,dd,J = 5.0,3.0 Hz,H-3′),4.16 (1H,dd,J = 5.0,3.0 Hz,H-4′),3.88 (1H,dd,J = 12.0,2.5 Hz,H-5′),3.75 (1H,dd,J = 12.0,3.0 Hz,H-5′)；13C-NMR (125 MHz,CDCl3) δ: 156.4 (C-6),151.6 (C-8),150.2 (C-5),142.7 (C-2),121.1 (C-4),91.3 (C-1′),88.2 (C-4′),75.9 (C-2′),72.6 (C-3′),63.4 (C-5′)。以上数据与文献报道一致[9]，故鉴定化合物6为腺苷。

化合物7：无色粉末（氯仿）。1H-NMR (500 MHz,CDCl3) δ: 8.65 (1H,s,-OH),8.55 (1H,s,-OH),6.60 (1H,d,J = 7.5 Hz,H-5),6.57 (1H,d,J = 2.0 Hz,H-2),6.42 (1H,dd,J = 2.0,7.5 Hz,H-6),4.51 (1H,d,J = 5.0 Hz,-OH),3.50 (2H,m,H-8),2.53 (2H,t,J = 7.5 Hz,H-7)；13C-NMR (125 MHz,CDCl3)δ: 144.8 (C-3),143.2 (C-4),130.1 (C-1),119.3 (C-6),116.2 (C-5),115.3 (C-2),62.5 (C-8),38.4 (C-7)。以上数据与文献报道一致[10]，故鉴定化合物7为羟基酪醇。

化合物8：淡黄色粉末（DMSO）。1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6) δ: 8.13 (1H,s,H-2),7.92 (1H,d,J = 9.0 Hz,H-5),6.97 (1H,d,J = 8.0 Hz,H-6′),6.91 (1H,dd,J = 9.0,2.5 Hz,H-6),6.83 (1H,d,J = 2.5 Hz,H-8),6.34 (1H,d,J = 2.0 Hz,H-3′),6.26 (1H,dd,J = 8.0,2.0 Hz,H-5′)。以上数据与文献报道一致[11]，故鉴定化合物8为2′,4′,7-三羟基异黄酮。

化合物9：黄色粉末（氯仿）。1H-NMR (500 MHz,CDCl3) δ: 12.3 (1H,s,-OH),12.1 (1H,s,-OH),7.63 (1H,brs,H-5),7.28 (1H,d,J = 2.5 Hz,H-4),7.10 (1H,brs,H-7),6.67 (1H,d,J = 2.5 Hz,H-2),5.75 (1H,brs,3-OH),2.45 (3H,s ,CH3)。以上数据与文献报道一致[12]，故鉴定化合物9为大黄素。

4 活性筛选

采用MTT法测定细胞相对抑制率，取对数生长期IEC-6细胞，用0.25%胰酶消化，调整细胞密度为1×104个/mL，以每孔100 μL的体积将细胞接种于96孔板中，设给药组、阴性对照组、空白组，各组均设6个复孔，置37 ℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养24 h使细胞贴壁，然后加入每孔100 L不同浓度的1～4、9的供试品溶液，使得各供试品的终浓度为3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL。阴性对照组加入等体积细胞培养液，置于37 ℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液（浓度为5 mg/mL），继续培养4 h，轻轻吸弃上清，每孔加二甲基亚砜（DMSO）150 μL，水平摇床混匀，使结晶物充分溶解。置酶标仪于490 nm波长处测定吸光度（A）值。按下式计算给药前后IEC-6的生长抑制率（IR），求算IC50值。测定结果见表 1。

表 1 化合物1～4、9对大鼠小肠隐窝上皮细胞株IEC-6 增殖的影响 Table 1 Effect of compounds 1—4 and 9 from root tubers of E. kansui on proliferation ofIEC-6 cells

由实验结果看出，巨大戟烷型二萜类成分化合物3的IC50值较小，具有较强的肠细胞毒性，且随浓度的增加，细胞增殖抑制率增大，具有一定的量-毒关系。假白榄烷型二萜类化合物1和三萜类化合物4未显示出较好的细胞毒性作用。据文献资料显示，大黄素具有致泻的作用[13]，并且具有抑制细胞增殖的作用[14]，实验结果得出大黄素（9）对肠上皮细胞ICE-6具有较好的抑制作用。

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