甘遂始载于《神农本草经》，为大戟科大戟属植物甘遂Euphorbia kansui T. N. Liou ex T. P. Wang的干燥块根^[1]。其性寒，味苦，有毒，素有峻下逐水圣药的美称。研究表明，甘遂有强烈的皮肤刺激性和严重的肝脏、胃肠道毒性以及促炎、诱发肿瘤等毒性^[2]。其毒性成分以二萜、三萜类为主，主要集中在醋酸乙酯和石油醚部位^{[3, 4]}。中医采用醋制降低其毒性，且临床上内服多为醋制^[3]。本实验室前期研究亦表明，甘遂醋炙后的醋酸乙酯部位可明显减轻其对小鼠肝脏、胃肠道的氧化损伤^{[5, 6]}。但迄今为止，甘遂醋炙减毒作用机制尚缺乏深入探讨。因此，本实验拟采用整体动物模型，从细胞、分子水平考察甘遂醋炙前后醋酸乙酯部位对小鼠胃肠黏膜通透性的影响，以期为探讨甘遂醋炙减毒机制提供理论依据。

In Situ Cell Death Detection Kit，AP（购自Roche公司，批号16845720009）；E-钙黏蛋白抗体（批号2598-4）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1，批号2491-0），购自美国Santa Cruz公司；即用型快速免疫组化MaxVision^TM试剂盒（批号44558S）、DAB显色试剂（批号87552G）购自福州迈新生物公司。

EL340全自动酶标仪（美国Bio-Tek Instruments 公司）；Powerwave X340全波长酶标仪（美国Bio-Tek公司）；TGL—16M高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；WH—90A微型漩涡混悬器（上海振荣科学仪器有限公司）；JEM—1200EX透射电子显微镜（日本JEOL公司）。

甘遂采自陕西宝鸡县赤沙乡，经南京中医药大学王春根教授鉴定为大戟科植物甘遂Euphorbia kansui T. N. Liou ex T. P. Wang的块根。

ICR小鼠，雌雄各半，体质量（20±2）g，由扬州大学比较医学中心提供，动物合格证号为SCXK（苏）20070001。

取净甘遂2.5 kg打粉（得率为99.9%），备用；甘遂醋炙品（醋甘遂）：取净甘遂2.5 kg置不锈钢容器中，用米醋750 g拌匀，闷透，待醋被充分吸尽后，置已加热到260 ℃的炒锅中，不断翻炒至颜色加深略有焦斑时，取出，放凉，打粉（得率为99.8%），备用。

将甘遂和醋甘遂粗粉（过24目筛），分别加95%乙醇50 ℃温浸5次至温浸液近无色，分别合并温浸液，50 ℃减压回收溶剂至近干，浸膏分别加0.104 kg和0.130 kg硅藻土拌样，加适量醋酸乙酯，采用磁力搅拌器搅拌提取5次，至醋酸乙酯萃取液近无色，分别合并萃取液，50 ℃减压回收溶剂至干（甘遂和醋甘遂的醋酸乙酯部位浸膏得率分别为19.7%和18.9%，浸膏中大戟二烯醇的质量分数分别为4.73、3.94 mg/kg）。临用前，用0.5%的CMC-Na溶液配成相当于生药量256 g/kg的供试品药液。

将30只ICR小鼠置于室温、通风的清洁级动物室中，自由摄食饮水，适应3 d后，按体质量、性别随机分为3组，每组10只，即对照组、甘遂醋酸乙酯部位组（简称甘遂组）、醋甘遂醋酸乙酯部位组（简称醋甘遂组）。甘遂组和醋甘遂组均ig给予上述供试品药液（相当于生药量256 g/kg），对照组给予等体积0.5% CMC-Na溶液，均为20 mL/kg，每日1次，连续ig给药7 d，于第7天给药1 h后，脱颈椎处死小鼠，取胃、肠组织，待测。

取各组小鼠部分胃、肠组织，切成1 cm×1 cm的组织片，放入2.5%戊二醛后1%锇酸再固定1 h，丙酮脱水，Epon-812树脂包埋，45～65 ℃聚合48 h，半薄切片定位，70 nm超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅双重电子染色，JEM—1200EX型透射电镜观察。

取各组小鼠的胃、肠组织，用4%中性多聚甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋、切片，采用快速免疫组化方法，按即用型快速免疫组化MaxVision^TM试剂盒说明书进行操作。以PBS代替一抗作为空白对照。采用Image-Pro-Plus 4.0图像分析软件（Media Cybernetics）分析E-钙黏蛋白及VCAM-1切片，测定胃、肠细胞质和（或）细胞核内棕黄色颗粒的累积吸光度。

实验数据采用SPSS 19.0软件进行统计分析，数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD检验。

电镜结果显示，对照组胃上皮细胞呈立方状或低柱状，胞质内大量线粒体，细胞核形态规则（图 1-A）；胞质内线粒体丰富，大小不一，结构尚好（图 1-B）。甘遂组胃固有腺体上皮细胞排列紊乱，细胞质电子密度不均匀，细胞核形态不规则（图 1-C）；线粒体形态、大小比较一致，部分细胞内溶酶体电子密度不一致，有一个高密度的核心（图 1-D）；部分腺上皮表面有大量溶酶体（分泌颗粒）分布，溶酶体电子密度高、均匀，大小比较一致（直径200～400 nm）（图 1-E）。醋甘遂组胃组织大多数上皮细胞呈立方状、低柱状，形态规则（图 1-F）；胞质内线粒体、内质网丰富，部分细胞线粒体畸形，嵴断裂（图 1-G）。

图 1 对照组 (A、B)、甘遂组 (C、D、E) 和醋甘遂组 (F、G) 小鼠胃组织电镜图Fig. 1SEM photographs of stomach tissue of mice in control group (A,B), Kansui Radix group (C,D,E),and Kansui Radix stir-baked with vinegar group (F,G)

电镜结果显示，对照组肠细胞表面微绒毛丰富、长而规则，基底张力细丝丰富（图 2-A）；紧密连接及桥粒结构良好，线粒体丰富，形态规则，结构良好（图 2-B）。甘遂组肠上皮细胞表面微绒毛数量减少、高度变矮，结构尚好，细胞间连接丰富，但近表面的紧密连接较短（图 2-C）；细胞间桥粒结构良好，线粒体形态不规则，内有高电子密度颗粒（图 2-D）；细胞器（线粒体、内质网糖原颗粒）较丰富，线粒体形态不规则，部分线粒体内见高电子密度的颗粒（图 2-E）。醋甘遂组肠上皮细胞排列规则，细胞形态一致，表面微绒毛数量减少、高度变矮，但较规则（图 2-F）；细胞间连接结构良好，表面的紧密连接结构良好（图 2-G）；线粒体结构良好（图 2-H）。

图 2 对照组 (A、B)、甘遂组 (C、D、E) 和醋甘遂组 (F、G、H) 小鼠肠组织电镜图Fig. 2 SEM photographs of intestinal tissue of mice in control group (A,B),Kansui Radix group (C,D,E),and Kansui Radix stir-baked with vinegar group (F,G,H)

与对照组比较，甘遂组可以明显提高胃、肠组织中E-钙黏蛋白灰度值，即降低胃、肠组织中E-钙黏蛋白表达（P＜0.05）；与甘遂组比较，醋甘遂组可明显降低E-钙黏蛋白灰度值，即提高胃、肠组织中E-钙黏蛋白表达（P＜0.05），结果见图 3及表 1。

图 3 甘遂醋炙前后对小鼠胃 (A) 和肠组织 (B) E-钙黏蛋白表达的影响Fig. 3 Effectof Kansui Radix before and after vinegar-processingon expression of E-cadherin in stomach tissues (A) and intestinal tissue (B) of mice

与对照组比较，甘遂组可以明显降低胃、肠组织VCAM-1灰度值，即提高胃肠组织VCAM-1表达（P＜0.05）；与甘遂组比较，醋甘遂组可明显提高VCAM-1灰度值，即降低胃组织VCAM-1表达（P＜0.05），结果见图 4及表 1。

胃肠黏膜上皮细胞、上皮细胞之间的紧密连接和黏附连接在维持黏膜通透性中有着十分重要的作用^[7]，可以调节水电解质和一些营养物质的转运，并防止胃肠道受损。一旦胃肠道受损，黏膜通透性会增加，毒素等容易侵入，可引起炎症反应。通过电镜观察胃肠黏膜上皮细胞的超微结构可准确判断胃肠黏膜受损及炎症情况。钙黏蛋白超家族是介导同型细胞间黏附的一组跨膜糖蛋白，其中E-钙黏蛋白介导上皮细胞间黏附。黏附分子VCAM-1是黏附分子中的免疫球蛋白超家族中的主要亚家族，系跨膜表达于血管内皮细胞上的单链糖蛋白。现代毒理学研究发现，缺血缺氧、缺血再灌注、氧化损伤、炎症介质、内毒素、营养障碍、微生态平衡失调、胃肠道黏膜免疫功能受损等易引起胃肠黏膜损伤，且氧化损伤是最重要的致病因素之一^{[8, 9]}。研究表明，机体自由基产生过多可诱导脂质过氧化反应，

表 1(Table 1)

表 1 甘遂和醋甘遂对小鼠胃、肠组织E-钙黏蛋白和VCAM-1蛋白表达的影响(x±s,n=6) Table 1 Effectsof Kansui Radix and Kansui Radix stir-baked with vinegar on expression of E-cadherin and VCAM-1 protein in stomach and intestinal tissues of mice(x±s,n=6) 组 别 E-钙黏蛋白灰度值 VCAM-1灰度值 胃组织 肠组织 胃组织 肠组织 对照 5 423.80± 250.01 4 987.25± 448.17 8 779.25±1 110. 40 7 667.80±983.72 甘遂 6 699.67±1 087.24 7 190.00±1 640.35 6 917.25± 739.42 6 516.00±449.35 醋甘遂 5 220.60± 666.50# 5 234.00± 293.49# 7 218.75± 217.58# 6 519.60±464.98 与对照组比较：*P＜0.05；与甘遂组比较：#P＜0.05 *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs Kansui Radix group

表 1 甘遂和醋甘遂对小鼠胃、肠组织E-钙黏蛋白和VCAM-1蛋白表达的影响(x±s,n=6) Table 1 Effectsof Kansui Radix and Kansui Radix stir-baked with vinegar on expression of E-cadherin and VCAM-1 protein in stomach and intestinal tissues of mice(x±s,n=6)

图 4 甘遂醋炙前后对小鼠胃 (A) 和肠组织 (B) VCAM-1蛋白表达的影响Fig. 4 Effectof Kansui Radix before and after vinegar-processingon expression of VCAM-1 in stomach tissues (A) and intestinal tissue (B) of mice

损伤细胞膜，破坏黏膜上皮细胞间的紧密连接和黏附连接，造成E-钙黏蛋白的表达降低，VCAM-1的表达增高，从而导致黏膜通透性增加，毒素等侵入并引起炎症反应^{[10, 11, 12]}。

甘遂生品醇提物LD₅₀约为22 mg/g，相当于生药量260 mg/g^[13]，为更好地体现甘遂的毒性，以利醋制减毒机制的研究，故本实验给药剂量设为256 g/kg。本实验结果表明，醋炙可以明显降低甘遂对小鼠胃肠黏膜的损伤，其对小鼠胃肠道黏膜通透性的影响可能与以下因素有关：与甘遂相比，醋甘遂减弱了胃肠黏膜中E-钙黏蛋白和VCAM-1的异常表达，减少了胃肠上皮细胞黏附强度的异常降低，从而降低了对胃肠道细胞膜通透性的影响，进而减少了毒素、病原微生物等对胃肠道细胞的破坏。

甘遂因对胃肠道的毒性，严重影响了临床应用。本实验从细胞膜蛋白的角度研究了其醋炙减毒的机制，但由于实验的局限性，尚有待从DNA、细胞质蛋白等角度进行更深入的研究。