续断Dipsaci Radix为川续断科多年生草本植物川续断Dipsacus asper Wall. ex Henry的根，因能“续折接骨”而得名。《滇南本草》记载：“补肝，强筋骨，定经络，止经中（筋骨）酸痛……”。临床上用于腰背酸痛、肢节痿痹、跌扑创伤、损筋折骨、胎动漏红、血崩、遗精、带下、痈疽疮肿。续断传统多采用“发汗”的产地加工方法^[1]，“发汗”除了干燥目的外，还伴随着性状的变化，即药材内部变绿，此多是由于化学成分的变化引起的。相关学者研究发现，续断经产地加工发汗后，其水溶性浸出物和药效成分总皂苷及川续断皂苷VI均降低，因而对药材有无必要“发汗”持怀疑态度^{[2, 3, 4, 5]}。本课题组前期比较了不同产地的发汗前后的续断，结果发现，经发汗加工后，续断中水溶性浸出物、醇溶性浸出物、总皂苷、绿原酸的量均有所降低，而川续断皂苷VI的量有所升高^{[6, 7]}。然而仅凭这几种成分的变化难以阐明续断发汗的真正机制，应从续断经发汗产地加工后可能引起系列成分变化的角度，进行整体药材质量评价。本实验采用HPLC-ESI-MS建立了续断发汗前后的分析方法，并通过与对照品和质谱信息对照，对部分成分进行了指认，为全面评价续断发汗前后的药材质量奠定了基础。

Agilent 1200高效液相色谱-6410三重四极杆质谱联用仪，美国Agilent仪器公司；AG285电子天平，0.01 mg，Mettler，Switzerland；KQ—500E型超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

对照品：马钱苷酸（批号111865-201102，质量分数93.8%）、绿原酸（批号110753-201314，质量分数96.6%）、咖啡酸（批号110885-200102，质量分数100.0%）、马钱苷（批号111640-201005，质量分数99.2%）、川续断皂苷VI（批号111685-201003，质量分数93.5%），购自中国食品药品检定研究院；川续断皂苷乙（批号33289-85-9，质量分数98.0%），购自成都曼思特生物技术有限公司；α-常春藤皂苷（批号BW60211，质量分数98.0%）、常春藤皂苷元（批号BW6423，质量分数98.0%），购自北京北研馨绿生物技术有限公司。甲醇、甲酸为分析纯；乙腈为色谱纯；水为娃哈哈纯净水。

续断样品采自四川西昌，经浙江中医药大学来平凡教授鉴定为川续断科植物川续断Dipsacus asper Wall. ex Henry的干燥根；未发汗样品为续断经采集后于80 ℃条件下烘干而成，发汗样品为续断采新后经产地发汗加工后而成。

精密称取对照品（马钱苷酸、绿原酸、咖啡酸、马钱苷、川续断皂苷乙、川续断皂苷VI、α-常春藤皂苷和常春藤皂苷元）各1.5 mg于10 mL量瓶中，用甲醇定容，制成质量浓度0.15 mg/mL的对照品混合溶液，0.45 μm微孔滤膜滤过，备用。

取过80目筛的样品粉末0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声（功率100 W，频率40 kHz）处理30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，即得。

Agilent 1200型高效液相色谱仪，色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱：0～45 min，6%～20%乙腈；45～90 min，20%～35%乙腈；90～110 min，35%～70%乙腈；110～120 min，70%乙腈；柱后平衡时间为10 min；柱温为25 ℃；体积流量0.8 mL/min；检测波长212 nm；进样量为10 μL。

Agilent 6410三重四极杆质谱仪，离子源：电喷雾源（ESI）；扫描范围：m/z 100～2 000；干燥气：氮气，体积流量10 L/min；雾化气压力103.44 kPa；干燥气温度300 ℃；毛细管电压4.0 kV；离子检测模式：全扫描检测；离子极性：正、负离子；扫描时间0.5 s；碎裂电压135 V；增加电压值400 V。检测到续断主要的分子离子峰有 [M－H]^-、[M＋HCOO]^-、[M＋H]⁺、[M＋Na]⁺。

将续断未发汗和发汗样品按照“2.2”项的方法制备溶液，采用“2.3”项和“2.4”项的方法进样分析，所得到的HPLC-ESI-MS图谱见图 1，各得到42个峰。

通过质谱分析，得到了各个色谱峰在负离子模式下（[M－H]^-、[M＋HCOO]^-）和在正离子模式下（[M＋H]⁺、[M＋Na]⁺）的质谱信息，进而来确定各个化合物的相对分子质量。通过与8个对照品的保留时间和质谱信息进行对照（图 1），再结合文献信息，最终推断出了31个色谱峰所对应的化合物，结果见表 1。

从续断发汗前后成分比较中初步得知，续断发汗后，有些成分的量降低（如马钱苷酸异构体、马钱苷酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、马钱苷、异绿原酸B、续断苷A、续断苷B等）；有些成分的量升高（如茶茱萸苷、川续断皂苷X、川续断皂苷VI、川续断皂苷VII、川续断皂苷乙、川续断皂苷VI同分异构体、川续断皂苷XIII、川续断皂苷IV同分异构体、川续断皂苷A等）；其他成分的量几乎不变（如异绿原酸A、异绿原酸C、3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖-常春藤皂苷元-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、川续断皂苷V、川续断皂苷IX、川续断皂苷XI、灰毡毛忍冬次苷D、α-常春藤皂苷、3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖-常春藤皂苷元、常春藤皂苷元等）。尚未发现新增或消失的成分。也许正是这些变化的成分在影响着续断发汗前后的质量差异。

图 1 8个对照品的总离子流图 (A-负离子模式，B-正离子模式)、续断的负离子总离子流图 (C-未发汗样品，D-发汗样品) 和续断的正离子总离子流图 (E-未发汗样品，F-发汗样品) Fig. 1 TIC of eight reference compounds (A-negative ion mode,B-positive ion mode),negative ion TIC of Dipsaci Radix (C-crude sample,D-sweated sample),and positive ion TIC of Dipsaci Radix (E-crude sample,F-sweated sample)

表 1(Table 1)

表 1 续断的HPLC-ESI-MS数据及化合物归属 Table 1 HPLC-ESI-MS data and compounds attribution of Dipsaci Radix 峰号 tR / min 负离子模式 正离子模式 相对分 子质量 分子式 化合物归属 [M－H]- [M＋HCOO]- [M＋H]+ [M＋Na]+ 1 2.803 / 2 4.091 / 3 14.183 374.9 399.0 376 C16H24O10 马钱苷酸异构体[8] 4 15.908 374.9 399.0 376 C16H24O10 马钱苷酸*[8] 5 18.326 352.9 377.0 354 C16H18O9 隐绿原酸[9] 6 19.741 352.8 377.0 354 C16H18O9 绿原酸*[9] 7 23.759 178.9 203.0 180 C9H8O4 咖啡酸*[10] 8 27.096 434.9 413.0 390 C17H26O10 马钱苷*[8] 9 44.274 627.2 / 10 48.272 515.0 538.9 516 C25H24O12 异绿原酸B[11] 11 48.923 761.0 785.1 / 12 50.369 514.9 539.0 516 C25H24O12 异绿原酸A[11] 13 53.520 745.0 769.0 746 C33H46O19 茶茱萸苷[8] 14 54.563 514.9 539.0 516 C25H24O12 异绿原酸C[11] 15 56.867 931.0 933.1 / 16 61.278 1 473.2 1 497.5 1 474 C66H90O37 续断苷A[12] 17 62.135 1 473.2 1 497.4 1 474 C66H90O38 续断苷B[12] 18 64.738 931.0 933.1 / 19 74.675 1 675.5 1 699.8 1 676 C76H124O40 川续断皂苷X[13] 20 77.692 1 235.4 1 259.4 1 236 C59H96O27 川续断皂苷VII[14] 21 78.529 973.2 951.3 928 C47H76O18 川续断皂苷VI同分异构体[15] 22 79.066 648.2 / 23 80.150 1 073.3 1 097.4 1 074 C53H86O22 川续断皂苷乙*[16] 24 81.132 973.1 951.3 928 C47H76O18 川续断皂苷VI同分异构体[15] 25 81.762 973.1 951.3 928 C47H76O18 川续断皂苷VI*[15] 26 84.365 1 659.5 1 683.4 1 660 C76H124O39 川续断皂苷XIII[17] 27 88.673 1 015.2 993.3 970 C49H78O19 川续断皂苷IV同分异构体[18] 28 90.925 1 015.2 993.3 970 C49H78O19 川续断皂苷IV同分异构体[18] 29 93.114 1 015.2 993.3 970 C49H78O19 川续断皂苷IV同分异构体[18] 30 94.375 841.2 819.2 796 C42H68O14 川续断皂苷A[19] 31 94.953 811.1 789.1 766 C41H66O13 3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖-常春藤皂苷元- 28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[20] 32 96.265 957.2 935.3 912 C47H76O17 川续断皂苷V[18] 33 98.845 1 057.2 1 035.2 / 34 100.645 1 351.5 1 375.4 1 352 C64H104O30 川续断皂苷IX[13] 35 101.007 1 219.4 1 243.5 1 220 C59H96O26 川续断皂苷XI[17] 36 101.513 1 057.2 1 035.4 / 37 103.682 911.2 935.3 912 C47H76O17 灰毡毛忍冬次苷D[20] 38 104.415 881.3 905.2 / 39 106.616 795.3 773.4 C41H66O12 α-常春藤皂苷*[20] 40 109.425 649.1 627.2 604 C35H56O8 3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖-常春藤皂苷元[18] 41 110.686 473.1 497.2 / 42 112.690 471.1 495.2 472 C30H48O4 常春藤皂苷元*[21] *与对照品确认 *to confirm with reference

表 1 续断的HPLC-ESI-MS数据及化合物归属 Table 1 HPLC-ESI-MS data and compounds attribution of Dipsaci Radix

本实验采用液质联用方法，结合全扫描的离子检测模式，建立了续断发汗与未发汗样品的成分分析图谱，各得到了42个色谱峰，推断出了其中的31个化合物，较文献报道的多^[22]，所得指纹图谱的成分信息量大，可用作续断“发汗”全面质量控制的评价依据。

本实验对影响分析方法建立的关键条件进行了考察。考察了流动相系统甲醇-水、乙腈-水、甲醇- 0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液，最终确定了乙腈-0.1%甲酸水溶液系统；考察了碎裂电压100、110、120、130、135、140、150 eV，最终选择了135 eV；考察了干燥气的体积流量6、8、10 L/min，最终选择了10 L/min；考察了雾化气压力68.96、103.44、137.92 kPa等，最终选择了103.44 kPa；考察了离子化温度250、300、350 ℃，最终选择了350 ℃。