2014, Vol. 48
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.22.004 |
芍药是我国中医临床常用中药材，历史悠久，应用广泛，有白芍与赤芍之分。其中白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall. 的干燥根；赤芍为毛茛科植物芍药或川赤芍P. veitchii Lynch的干燥根[1]。白芍主产于安徽、浙江等地，主要为栽培品，置沸水中煮后除去外皮或去皮后再煮，晒干而得。而赤芍主产于内蒙古多伦县附近，其多为野生品，以生品入药[2]。赤芍、白芍来源相近甚至相同，但临床上却不可混用，白芍、赤芍同为寒性药，具有清热的共性，但白芍属补虚药，长于补血平抑肝阳；赤芍属清热药，功偏清热凉血祛瘀[2, 3]。
近年来的化学研究表明，白芍和赤芍中主要成分是单萜苷及多元酚类化合物。单萜苷类主要包括芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、羟基芍药苷、苯甲酰羟基芍药苷等，多元酚类化合物则包括多种没食子酰葡萄糖、丹皮酚等[4, 5, 6]。对于两者的化学差异，有文献以芍药苷、芍药内酯苷、丹皮酚等为指标采用HPLC定量测定方法或液相指纹图谱进行了比较，结果显示白芍中芍药内酯苷、芍药苷亚硫酸酯等较多，而赤芍中芍药苷、丹皮酚等较多[7, 8, 9, 10]。
植物代谢组学技术是以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，具有整体观的研究思路。基于核磁共振的代谢组学技术近年来开始广泛地应用于中药材的质量分析，如款冬[11]、柴胡[12]、远志[13]、人参[14]等。相对于液相色谱，核磁共振的优势体现在可以检测大部分的有机化合物，尤其适合于无紫外吸收或色谱柱上不保留的化合物，此外，核磁共振指纹中的化学位移、耦合常数、峰型等可以给出药材样品的化学结构信息；另外，代谢组学技术与多元统计分析手段结合不仅可以确定样本之间的相似性或均一性，而且可以确定引起组间差异的化学成分。因此，在中药材质量评价与分析中，作为一种整体性分析技术，核磁共振代谢组学分析是液相色谱指纹图谱的有力补充[15]。
本研究拟采用基于NMR代谢组学技术建立白芍与赤芍的核磁共振指纹图谱，并采用多元统计分析技术从整体上阐明白芍与赤芍的化学成分差异，为白芍与赤芍的质量控制及功效与化学成分的相关性研究提供依据。
1 材料与方法 1.1 材料本研究收集的白芍和赤芍样品见表 1，每批样品平行备样2份。样品经山西大学秦雪梅教授鉴定，赤芍和白芍分别为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall. 未去皮和经去皮水煮后的干燥根，标本保存在山西大学中医药现代研究中心。
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表 1 白芍与赤芍样品 Table 1 Samples of Paeoniae Alba Radix and Paeoniae Rubra Radix |
Bruker 600-MHz AVANCE III NMR Spectrometer（600.13 MHz质子频率，德国布鲁克公司600兆核磁仪）。超声波清洗器（KQ5200E，昆山市超声仪器有限公司），旋转蒸发仪（RE—52A，上海亚荣生化仪器厂），SC—3610低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），TGL—16高速台式冷冻离心机，分析纯甲醇，分析纯氯仿，娃哈哈纯净水，NMR试剂：重水（Norell，Landisville公司，美国），氘代甲醇、氘代氯仿（99.8%，Merck公司，德国），氘代氢氧化钠（Armar公司，瑞典），三甲基硅烷丙酸钠盐（TSP，Cambridge Isotope Laboratories Inc.，MA）。
1.3 核磁样品制备参照文献报道[16]方法进行供试品制备。精密称取液氮研磨后的芍药样品粉末各200 mg，置于10 mL离心管中，分别加蒸馏水及甲醇各1.5 mL，氯仿3 mL，漩涡混匀1 min，超声提取25 min，室温下离心（3 500 r/min）25 min，提取液分为2层（上层为水溶性部分即甲醇水相，下层为氯仿相），用移液枪分别转移至25 mL圆底烧瓶中，减压浓缩蒸干。于测定前用NMR试剂溶解，其中甲醇水相层用氘代甲醇400 μL与缓冲重氢水（缓冲液：KH2PO4溶于D2O中，以1 mol/L氘代氢氧化钠溶液调节pH值至6.0，含0.1% TSP）400 μL溶解，溶解液分别转移至1.5 mL离心管中，离心（13 000 r/min）10 min，移取上清液600 μL于5 mm核磁管中待测，而氯仿相部分用氘代氯仿600 μL溶解，直接转移到5 mm核磁管中待测。
1.4 1H-NMR测定及条件样品在25 ℃下于600 MHz NMR仪上测定，测定频率为600.13 MHz，扫描次数为64，谱宽12 345.679 Hz，傅里叶变换0.188 Hz，脉冲间隔D1为1 s，延迟时间为5.0 s，相位调节、基线调节及峰校正均为手动。甲醇水相提取物核磁测定采用noesyppr1d序列压制水峰，用氘代甲醇进行锁场，内标为TSP。氯仿相提取物核磁测定采用zg30序列，用氘代氯仿锁场，内标为TMS。
1.5 数据分析核磁图谱采用MestReNova（version 8.0.1，Spain）进行处理。核磁图谱经过定标、相位、基线校准后，以δ 0.04积分段对化学位移区间进行分段积分。甲醇水相核磁图谱中对化学位移δ 0.74～8.94进行分段积分，其中δ 4.80～5.06（残余水峰）和δ 3.30～3.34（残余甲醇峰）不进行积分，氯仿相核磁图谱中对化学位移δ 0.66～12.78进行分段积分，其中δ 7.10～7.38（残余氯仿峰）不进行积分。将积分后的数据导入Excel中，进行后续分析。
首先将Excel中的积分数据导入SPSS 16.0软件中进行层次聚类分析（HCA），采用组间联结（Between-groups）法，以夹角余弦（cosine）作为测度对样品进行分析。然后将其导入SIMCA-P 13.0（Umetrics，Umea，瑞典）软件中进行主成分分析（PCA），再用偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA），找出差异代谢产物。根据分析结果，对差异代谢产物相对峰面积进行t检验，以期找出显著性差异代谢产物。此外，将差异代谢物数据导入代谢组学分析网站（http://www.Metaboanalyst.ca），计算出差异代谢产物的Pearson相关系数并作图，以期找出差异物之间的相关性。
2 结果与分析 2.1 代谢组学分析采用氯仿-甲醇-水（2∶1∶1）两相提取法，得到芍药样品的甲醇水相和氯仿相提取物。通过对照品对照、文献报道数据以及BMRB数据库中的标准物质对照，从白芍与赤芍图谱中指认出32个代谢产物（图 1）。其中甲醇水相中主要包括极性大的成分（图 1-A1：白芍甲醇水相，图 1-A2：赤芍甲醇水相），图谱大致可以分为3个区域，高场端（δ 3.10～0.00）主要包括有机酸和氨基酸，如丙氨酸、精氨酸、缬氨酸、柠檬酸和丁二酸等，此外还有单萜苷类次生代谢产物的甲基信号，包括芍药苷（δ 1.41,s），芍药内酯苷（δ 1.56,s），苯甲酰芍药苷（δ 1.25,s），6-O-没食子酰白芍苷（δ 1.38,s），4-O-没食子酰白芍苷（δ 1.59,s）等。碳水化合物区（δ 5.50～3.10）主要为糖类物质，包括α-葡萄糖、β-葡萄糖以及蔗糖等。低场区（δ 9.0～5.50）主要包括芳香化合物，包括儿茶素、没食子酸、1,2,3,4,6-五没食子酰基葡萄糖以及芍药苷类的苯甲酰基团（δ 7.53,t,J = 7.8 Hz；7.68,t,J = 7.8 Hz；8.05,dd,J = 8.4,1.2 Hz）。
 | 图 1 白芍与赤芍的1H-NMR图谱Fig. 1 1H-NMR spectra of Paeoniae Radix Alba and Paeoniae Radix Rubra |
氯仿相提取物中主要包括芍药的低极性成分（图 1-B1：白芍氯仿相，图 1-B2：赤芍氯仿相），通过对图谱的分析，指认出了脂肪酸（δ 2.36,t,J = 7.5 Hz；2.77,t,J = 6.6 Hz；1.2～1.3,m）、β-谷甾醇（δ 0.68,s）以及一些苯甲酸酯类（δ 8.07,d,J = 7.2 Hz；7.93,d,J = 7.8 Hz），另外还指认出赤芍中的特有成分丹皮酚（δ 12.76,s；7.63,d,J = 9.0 Hz；3.84,s；2.56,s；6.43,d,J = 2.4 Hz；6.43,dd,J = 9.0,2.4 Hz）。各类化合物的详细核磁数据见表 2。
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表 2 白芍与赤芍中主要化合物的NMR数据归属 Table 2 NMR assignments of major metabolites in Paeoniae Alba Radix and Paeoniae Rubra Radix |
芍药的化学组成复杂，所得核磁图谱提供了大量的化学指纹信息，直观分析显示白芍和赤芍的低极性成分和高极性成分均存在明显差异。下一步采用多元统计分析方法对两者进行深入比较。
2.2 多元统计分析 2.2.1 PCA分析PCA分析是在保留原始变量主要信息的前提下，通过降维技术把多个具有一定相关性的指标约化为少数几个综合指标的多元统计分析方法，且随着主成分的增加，其所包含的信息量越来越少。PCA分析的得分散点图能直观地显示不同样品之间的整体差异，且在得分图中，投影在某主成分上的绝对值越大，表明该主成分对该类的区分影响越大[17]。本研究中PCA分析所用软件为SIMCA-P13.0。
首先对白芍、赤芍样品的甲醇水相提取物进行PCA分析，由主成分1（PC1：41.1%）和主成分2（PC2：26.2%）为横纵坐标构建的得分散点图可直接观测出，白芍与赤芍样品可明显分开，说明二者之间组间差异较大，即二者化学组成差异大。在氯仿相的PCA得分散点图中，第1主成分和第2主成分共解释了54.4%（PC1：37.9%，PC2：16.5%）的原始变量信息，二者能明显分开，说明白芍与赤芍的低极性成分也存在较大的差异。不同批次的白芍样品比较聚集，说明组内差异小，而赤芍样品比较分散，说明组内差异较大，原因可能是白芍大多为栽培品，且本研究样品来源于主产区安徽亳州，因此差异相对较小；而赤芍大多为野生品，生长年限不定且分布范围较广所致。进一步采用HCA方法对两者的甲醇水相和氯仿相提取物进行分析，结果显示芍药样品明显聚为2大类，一类为白芍样品，一类为赤芍样品，与PCA分析结果一致。
PCA分析作为一种无监督的分析方法，只反映了数据的原始状态，观察到试验样品的自然分布和组别关系，但不能忽略组内误差，消除与研究目的无关的随机误差，忽略了数据的整体特征与变化规律，不利于寻找组间差异和差异代谢物。为了确定白芍与赤芍之间的化学差异成分，本研究采用有监督的PLS-DA分析和OPLS-DA分析对数据进行进一步分析[18, 19]。
2.2.2 PLS-DA分析及OPLS-DA分析PLS-DA分析和OPLS-DA分析是有监督的模式识别方法。PLS-DA分析着重强调组间的差异，而将组内的差异降至最低，更能把握多维数据的整体特征和变异规律。OPLS-DA分析可以去除与Y矩阵（在本研究中Y为分组信息）无关的X矩阵的变化，从而使X矩阵和Y变量之间的关系最大化，即可以使2组分类的差别达到最大，从而确定2组之间的化学差异成分[20]。
本研究先对白芍与赤芍进行PLS-DA分析，在甲醇水相提取物中，模型参数为R2＝91.0%，Q2＝95.0%，氯仿相的模型参数为R2＝91.2%，Q2＝97.2%。
另外，用外部模型验证方法排列实验来证明模型的有效性。在排列实验中，蓝色的回归线与纵轴相交并处于零点以下，左端任何一次随机排列产生的R2、Q2均小于右端，且2条回归线斜率较大，最右端的2个值差距较小，说明原始模型的预测能力大于任何一次随机排列y变量的预测能力，即证明了上述模型有效，可以继续后面差异成分的寻找。图 2-A、图 2-C分别为甲醇水相提取物和氯仿相提取物的OPLS-DA得分散点图，从图 2中明显得出，与无监督的PCA分析得分散点图相比，白芍与赤芍样本有最大程度的分离，且降低了样品的组内差异，这样便于更准确地寻找白芍与赤芍之间的化学差异成分。通过S-plots图（甲醇水相：图 2-B，氯仿相：图 2-D）和VIP值（大于1），寻找差异标志物。结果显示白芍中精氨酸、苏氨酸、乙酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、柠檬酸、丁二酸、乳酸、芍药内酯苷、6-O-没食子酰白芍苷、1,2,3,4,6-五没食子酰基葡萄糖以及没食子酸的质量分数较高，而赤芍中丙氨酸、α-葡萄糖、蔗糖、芍药苷、儿茶素、β-谷甾醇、脂肪酸以及丹皮酚的量较高。
 | 图 2 白芍与赤芍的多元统计分析Fig. 2 Multiple statistical analysis of Paeoniae Alba Radix and Paeoniae Rubra Radix |
在SPSS 16.0中进一步采用t检验对差异成分进行分析，白芍与赤芍中苏氨酸、乙酸、天冬氨酸、柠檬酸以及丁二酸具有显著性差异（P＜0.05），精氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、乳酸、芍药内酯苷、1,2,3,4,6-五没食子酰基葡萄糖、没食子酸、α-葡萄糖、儿茶素、β-谷甾醇、脂肪酸以及丹皮酚具有极显著性差异（P＜0.01）。
2.2.3 差异代谢物的相关分析为了寻找差异代谢物之间的相互关系，本研究分别计算白芍与赤芍样品差异代谢物的Pearson相关系数，并作相关系数图（图 3），图 3中红色表示正相关，蓝色表示负相关，颜色越深表示相关性越大，反之越小。由图 3可见，芍药中差异代谢产物间总体相关性较强，且白芍的相关性大于赤芍。
 | 图 3 差异代谢物的相关系数图Fig. 3 Correlation maps of different metabolites |
白芍样品中丙氨酸、精氨酸、苏氨酸、乙酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、柠檬酸以及丁二酸等初级代谢物之间的相关性比赤芍样品初级代谢物之间的相关性大，其中白芍中丙氨酸与精氨酸、乙酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、柠檬酸、丁二酸以及蔗糖呈强的负相关，而在赤芍中相关性较弱且偏向正相关，白芍中苏氨酸与乙酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、柠檬酸以及丁二酸呈强的负相关，而在赤芍中呈弱的正相关。白芍中β-谷甾醇与初级代谢产物乙酸、天冬氨酸、谷氨酸、γ-氨基丁酸、柠檬酸以及丁二酸呈负相关，而在赤芍中呈正相关。另外，芍药内酯苷、儿茶素、1,2,3,4,6-五没食子酰基葡萄糖、没食子酸等次级代谢产物与乙酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、柠檬酸、丁二酸等初级代谢产物呈现较强的正相关，相关性在赤芍中强于白芍。由此可以说明，白芍与赤芍不仅在初级代谢物相互之间的关系有较大差异，而且初级代谢物与次级代谢物相互之间的关系也有较大的差别。
3 讨论 本研究采用基于核磁共振代谢组学技术对白芍与赤芍的化学差异进行了比较，结果显示，白芍中含有较多的精氨酸、苏氨酸、乙酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、柠檬酸、丁二酸、乳酸、芍药内酯苷、6-O-没食子酰白芍苷、1,2,3,4,6-五没食子酰基葡萄糖以及没食子酸等，而赤芍中含有较多的丙氨酸、α-葡萄糖、蔗糖、芍药苷、儿茶素、β-谷甾醇、脂肪酸以及丹皮酚等。此外，白芍与赤芍两者在差异成分相关系数上也存在较大的差异。植物代谢物的生物合成与其所处的环境密切相关，本研究中的白芍与赤芍均来源于毛茛科植物芍药，两者代谢物的量与相关系数的差异反映了生长方式和生长环境的不同。白芍和赤芍中的芍药内酯苷、儿茶素、1,2,3,4,6-五没食子酰基葡萄糖、没食子酸等次级代谢产物与乙酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、柠檬酸、丁二酸等初级代谢产物存在正相关。
本研究发现两者的次级代谢产物芍药苷、芍药内酯苷、儿茶素等存在一定差异，且丹皮酚为赤芍的特有成分，结果与文献报道一致[8, 9, 10]。芍药化学成分复杂，除了芍药苷等单萜苷类次级代谢产物外，还含有氨基酸、糖类、有机酸等多种初级代谢产物，同时，本研究结果也揭示了白芍与赤芍在初级代谢产物上也存在较大差异，如白芍中含有较多的乳酸，而赤芍中几乎不含乳酸；白芍中葡糖糖较少，而赤芍中葡萄糖较多。中药在临床多为水煎入药，大量的初级代谢产物（如有机酸、氨基酸和糖类）随次级代谢产物同时煎出并被服用，这些初级代谢产物在芍药功效中发挥的作用值得进一步深入研究。核磁共振技术用于中药材分析，可以同时检测到样品中的次级代谢产物和初级代谢产物。然而核磁共振的灵敏度较低，在代谢组学研究中，多种技术手段的联用有助于样本的全面化学表征，下一步本课题组将采用液质联用技术，并扩大样本量对白芍和赤芍之间的化学差异进一步深入研究，为揭示两者化学差异与功效差异的相关性奠定基础。
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