穿心莲为爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata (Burm. f.) Nees的全草，有“天然抗生素”之称^[1]，原产印度、斯里兰卡等国，我国于20世纪70年代在广东、福建一带大量引种栽培^[2]。穿心莲的活性成分主要是穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯^[3]，为二萜内酯类化合物，具有清热解毒、凉血消肿之功效^[4]。ent-柯巴基焦磷酸合酶（ent-copalyl diphosphate synthase，CPS）是穿心莲二萜化合物合成途径中的重要调控位点^[5]，其表达水平决定了下游萜类化合物的组成和质量分数^[6]。随着抗生素滥用及不良反应的增加，穿心莲作为中药抗生素，需求量不断增加，引种范围不断扩大，由于各引种地区采收期标准不一，其质量存在很大差异，对药材的品质、产量以及资源的合理保护与开发利用都有着影响。本实验对主产地广东遂溪、福建漳浦及引种栽培地区江苏南京、淮安的不同生长期穿心莲活性成分积累动态及关键酶基因表达情况结合物候期进行分析，研究不同环境生态条件下穿心莲最佳采收期及其分子机制，为穿心莲的规范化生产、合理采收和质量控制提供科学指导。

实验地点设在穿心莲主产地广东遂溪（穿心莲GAP基地）、福建漳浦及引种地江苏南京及淮安，引种地穿心莲种子来源于广西贵港，按照GAP管理制度进行种植管理。样品由南京中医药大学谷巍教授鉴定为穿心莲Andrographis paniculata (Burm. f.) Nees。在7～10月分别于穿心莲叶期、蕾期、始花期、盛花期、果期^[7]不同生长期采集样品，分析其不同生长期药效成分的量；另采收部分新鲜样品保存于液氮（-196 ℃）中，备用，以分析其CPS基因表达量。

Agilent 2695高效液相色谱仪；Light Cycler 480荧光定量PCR仪（Roche公司）；Allegra 21R台式高速冷冻离心机；Hofer ΜV—25紫外透射仪。

脱水穿心莲内酯（批号110854-201308）、穿心莲内酯（批号110797-201108）对照品均由中国食品药品检定研究院提供；TRlzol Reagent（Ambion公司）；RT mix（Vazyme公司）；qPCR Master Mix（TaKaRa公司）；DEPC（Sigma公司）；SDS（Amresco公司）；Agarose（上海基因公司）；甲醇（色谱纯）；其余试剂均为分析纯。

在引种地区江苏南京，根据穿心莲的生长情况，于穿心莲各生长期采集样品，采摘后2 h内分别测定样品鲜质量、株高、叶片数、分叉数，取其平均值。采用《中国药典》2010年版方法测定植株含水量。

C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），甲醇-水（60∶40）为流动相，体积流量0.8 mL/min，柱温25 ℃；检测波长226 nm（用于检测穿心莲内酯），254 nm（用于检测脱水穿心莲内酯），进样量10 μL，色谱图见图 1。

A1 (B1)-226 nm A2 (B2)-254 nm 1-穿心莲内酯 2-脱水穿心莲内酯 A1 (B1)-226 nm A2 (B2)-254 nm 1-andrographolide 2-dehydroandrographolide图 1 对照品 (A) 和样品 (B) 的HPLC色谱图Fig. 1 HPLC chromatogram of reference substances (A) and samples (B)

分别称取穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照品适量，用甲醇配制成0.2 mg/mL的混合对照品溶液。

将穿心莲样品干燥粉碎，过40目筛，称取0.2 g样品，加甲醇5 mL超声提取0.5 h，用甲醇补足质量，摇匀，过0.45 μm滤膜，取续滤液，即得。

分别吸取对照品溶液10 μL，供试品溶液10 μL，进样，按外标法测定穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的量。

在引种地区江苏南京，于穿心莲各生长期收集叶片保存于液氮中。RNA提取按照TIANGEN公司总RNA提取试剂盒操作步骤进行，取2 μg总RNA以Oligo dT18为引物进行反转录。反转录采用2步进行：第1步，4×gDNA wiper Mix 2 μL，模板（RNA）250 ng，加RNase free ddH₂O至10 μL，混匀，42 ℃，2 min；第2步，5×qRT SuperMixll 2 μL，第1步反应液8 μL。反应条件：25 ℃，10 min；42 ℃，30 min；85 ℃，5 min。

采用实时荧光定量PCR仪，以β-actin为内参基因，检测样品中CPS基因的相对表达量。以不同生长期穿心莲叶片cDNA为模板，运用设计的引物进行PCR扩增，actin-F和actin-R及QRT-PCR引物见表 1。QRT-PCR反应体系：cDNA 2 μL，引物各0.4 μL，4×qPCR Master Mix 10 μL，ddH₂O 7.2 μL，总体积20 μL。PCR反应结束后分析荧光值变化曲线以及融解曲线。

表 1(Table 1)

表 1 引物序列 Table 1 Primer sequence 引物名称 引物序列 CPS-F CACCATCTCCGCCTGTCT CPS-R ACCACCACTCACGCCACT actin-F TTCACCACTACAGCAGAGCG actin-R AAGGACCTCAGGGCATCG

表 1 引物序列 Table 1 Primer sequence

使用SPSS软件对不同生长期穿心莲中CPS基因表达量与药效成分穿心莲内酯的量进行相关性分析。

4个产地穿心莲的物候期有所差异，江苏淮安的穿心莲其生长期相对较长，于9月中旬出现花蕾，果实成熟期相对较晚（10月下旬），其茎较长，质脆，生物量相对较高；广东的穿心莲一般于8月底出现花蕾；福建的在9月下旬结果。表 2为引种地江苏南京的穿心莲不同生长期的生物量变化，穿心莲幼苗生长缓慢，在6～8月，其株高增长较快，叶片数快速增多，生长较快，为快速生长期。在8月中旬，穿心莲出现花蕾，此后，植株生长缓慢，进入生殖生长期。

表 2(Table 2)

表 2 南京产穿心莲不同生长期生物量 Table 2Biomass of A. paniculata from Nanjing at different growth periods 采收期 株高 / cm 叶片数 / 片 分叉数 鲜质量 / (g·株-1) 含水量 / % 叶期 30.2±0.2 96±1 5±1 35.22±0.65 72.62±0.11 蕾期 46.0±0.3 118±1 9±1 59.29±0.84 79.96±0.11 始花期 51.5±0.4 129±1 11±1 63.08±0.42 72.80±0.08 盛花期 52.6±0.1 134±1 13±1 65.61±0.44 72.50±0.04 果期 52.8±0.2 126±1 13±1 66.30±0.03 68.08±0.05

表 2 南京产穿心莲不同生长期生物量 Table 2 Biomass of A. paniculata from Nanjing at different growth periods

4个产地穿心莲不同生长期的穿心莲内酯量变化趋势一致，其量均在始花期前快速增长，到始花期达到最大值，此后呈下降趋势。南京、淮安、遂溪、漳浦样品中，始花期穿心莲内酯量比叶期分别高了30.16%、20.06%、24.36%、19.04%，见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 不同产地不同生长期穿心莲中穿心莲内酯的量 Table 3 Contents of andrographolide in A. paniculata from different habitats at different growth periods 产地 穿心莲内酯 / % 叶期 蕾期 始花期 盛花期 果期 江苏南京 2.510±0.049 3.026±0.013 3.267±0.046 2.889±0.018 2.638±0.043 江苏淮安 2.770±0.022 3.137±0.012 3.381±0.042 3.054±0.015 2.190±0.033 广东遂溪 2.471±0.015 2.593±0.013 3.073±0.036 2.745±0.027 2.275±0.031 福建漳浦 2.658±0.011 2.753±0.019 3.164±0.007 2.708±0.027 2.420±0.057

表 3 不同产地不同生长期穿心莲中穿心莲内酯的量 Table 3 Contents of andrographolide in A. paniculata from different habitats at different growth periods

4个产地样品中脱水穿心莲内酯在不同生长期变化较平缓（表 4），其量总体为下降趋势。

表 4(Table 4)

表 4 不同产地不同生长期穿心莲中脱水穿心莲内酯的量 Table 4 Contents of dehydroandrographolide in A. paniculata from different habitats at different growth periods 产地 脱水穿心莲内酯 / % 叶期 蕾期 始花期 盛花期 果期 江苏南京 0.286±0.002 0.265±0.002 0.225±0.004 0.192±0.003 0.165±0.004 江苏淮安 0.303±0.002 0.269±0.003 0.265±0.002 0.206±0.001 0.163±0.003 广东遂溪 0.281±0.001 0.256±0.002 0.231±0.004 0.224±0.002 0.154±0.002 福建漳浦 0.262±0.002 0.222±0.003 0.216±0.003 0.184±0.005 0.163±0.001

表 4 不同产地不同生长期穿心莲中脱水穿心莲内酯的量 Table 4 Contents of dehydroandrographolide in A. paniculata from different habitats at different growth periods

实验结果显示，穿心莲CPS基因的相对表达量在穿心莲蕾期前呈快速上升趋势，在蕾期至始花期趋于平缓，之后缓慢下降（图 2）。

图 2 不同生长期穿心莲CPS基因表达量Fig. 2 CPS expression on mRNA at different growth periods of A. paniculata

使用SPSS统计软件对南京地区穿心莲样品中穿心莲内酯量与CPS基因表达量进行相关性分析，其相关性为0.909（P＜0.05），表明CPS基因表达量与穿心莲内酯量呈显著正相关。

不同生长环境、不同采收季节等因素都有可能影响中药材成分量。中医药传统理论中以季节作为中药材采收期依据缺乏对不同地区物候期的考虑，本实验各产地穿心莲生长物候期不完全一致，各地栽培环境条件亦不相同，研究结果表明其最佳采收期为始花期，最佳采收期的确定应以植物物候期作为依据，与药材产量、活性成分量相结合。

中药材有效成分的形成与积累除受环境条件的影响还受遗传因子的调控。焦磷酸香叶基香叶酯（GGPP）环合形成ent-焦磷酸古巴酯（ent-CDP）是穿心莲内酯生物合成的关键步骤，而催化这步反应的CPS是穿心莲内酯类成分合成的关键限速酶^[5]，对CPS基因不同生长期表达量与穿心莲内酯量积累动态的相关性分析进一步证实了CPS基因是穿心莲内酯类成分合成途径中的重要调控点，也为最佳采收期的确定提供分子水平的佐证。CPS基因在蕾期前快速增长，表明这段时期为穿心莲生长旺盛期，也是次生代谢产物合成的高峰期；开花后CPS基因mRNA 表达水平下降，这可能是穿心莲植株趋于衰老、代谢能力衰退所致^[10]。

《中国药典》2010年版穿心莲活性成分标准为穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯之和不得低于0.8%。本实验所有样品中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯之和均达到标准，引种地江苏南京及江苏淮安穿心莲活性成分量也均高于《中国药典》2010年版规定，有效成分的积累动态与广东、福建基本一致，且生物量也较高，表明穿心莲可以在江苏引种种植。