原发性高草酸盐尿症（PH）的临床主要表现为肾结石、肾钙盐沉积及肾外组织钙盐沉积^[1]。因而，高于人体正常的草酸质量浓度（尿草酸定量正常＜50 mg/L，血草酸定量正常＜5.4 mg/L）在结石形成过程中起着重要作用，因而监测人体尿液与血液中草酸的质量浓度是必可少的检测手段^{[2, 3, 4]}。本实验主要监测天津市第一中心医院收治的6例PH患者，实施肝肾联合移植术后尿液与血液中原先高于正常人体草酸质量浓度的降低状况，意在监测患者移植后的肝、肾功能的恢复状况。

本实验采用RP-HPLC法，以邻苯二胺为衍生剂，与尿液与血液中草酸反应，生成具有强紫外吸收化合物2, 3-二羟基喹喔啉。此衍生物与草酸具有一一对应的浓度关系，因而能准确测定人体尿液与血液中草酸质量浓度。

Aligent 1100型高效液相色谱仪，包括四元泵、在线脱气机、VWD检测器、色谱工作站（安捷伦科技有限公司）；AE240精密电子分析天平，梅特勒-上海托利多仪器；HGC—12D氮吹仪，天津市恒奥科技发展有限公司。

草酸对照品，天津市津科精细化工研究所，质量分数不少于99.9%，批号20120306；邻苯二胺（OPD）、磷酸二氢钾（分析纯）、醋酸铵（色谱纯），天津市致远化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯），德国Merk公司；浓盐酸、氢氧化钠、液体石蜡，天津市欧博凯化工厂品销售有限公司；实验用水为二次纯化水，天津市第一中心医院药厂提供。

收集24 h尿，按照尿液-浓盐酸（100∶1）酸化尿液。置于冰箱备用。

禁食12 h后抽上肢静脉血3 mL，肝素抗凝，立即以2 300 r/min于4 ℃离心10 min，取血浆1 mL加入1 mL乙腈和50 μL磷酸盐缓冲液（pH 7.0），混旋，2 000 r/min离心15 min，37 ℃N₂气流将上层液中的乙腈蒸发掉，用去离子水补足液体至1 mL。

取尿样1 mL于带盖离心管中，加入5 μL浓盐酸，0.5 mL OPD标准液（10 g/L）^[5]，旋紧盖子于140 ℃（采用液体石蜡升温，注意离心管中液体绝不能溢出）加热30 min，室温冷却，用5 mol/L NaOH调节pH 5～6，2 300 r/min离心15 min，上清液过0.22 μm微孔滤膜，取50 μL滤液上机测定。

取血浆上清液0.5 mL于带盖离心管中，加入5 μL浓盐酸，0.5 mL OPD标准液（10 g/L），旋紧盖子于140 ℃（采用液体石蜡升温，注意离心管中液体绝不得溢出）加热30 min，室温冷却，用5 mol/L NaOH调节pH 5～6，2 000 r/min，离心15 min，上清液经0.22 μm微孔滤膜滤过后取50 μL即可上机进行测定。

色谱柱为Agilent XDB C₁₈柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），Agilent Zorbax extend-C₁₈（12.5 mm×4.6 mm，5 μm）为预柱。流动相为甲醇-0.1 mol/L醋酸胺水溶液（15∶85），体积流量1.2 mL/min；紫外检测波长314 nm；柱温26.3 ℃；进样量50 μL。

取正常人的尿液，按尿液-浓盐酸（100∶1）的比例酸化尿液。用尿液配成质量浓度为1 g/L的草酸对照液，经衍生后，倍比稀释成质量浓度为125、62.5、31.25、15.625、7.813、1.953 mg/L草酸溶液；空白尿液也同时经衍生处理。经2 300 r/min离心15 min，上清液过0.22 μm微孔滤膜后取50 μL滤液进行色谱分析。以峰面积（A）对质量浓度（C，mg/L）进行线性回归，得工作曲线：A＝11.343 C＋56.599，r＝0.999 3。可见在1.953～125 mg/L，峰面积与草酸质量浓度呈良好的线性关系。按照信噪比3∶1，最低检测质量浓度为0.5 mg/L。

取正常人禁食12 h血8 mL，经上述血预处理与衍生处理后，用血浆制成质量浓度为125、62.5、31.25、15.625、7.813、1.953 mg/L草酸溶液；空白血浆也同时经衍生处理。经2 300 r/min离心10 min，上清液经0.22 μm滤过后进样进行色普分析。以峰面积（A）对质量浓度（C，mg/L）进行线性回归，得工作曲线A＝12.828 9 C＋3.239，r＝0.999 5。可见在1.953～125 mg/L，峰面积与草酸质量浓度呈良好的线性关系。按信噪比3∶1得最低检测质量浓度为0.3 mg/L。

分别对草酸对照品溶液、人尿液进行色谱分离，结果见图 1。从图 1中可见，草酸的分离均能达到基线分离，而且尿样中草酸的测定无明显杂质干扰，草酸的保留时间为7.2 min。

图 1 尿草酸对照品 (A) 和人尿液 (B) 的HPLC图Fig. 1HPLC of oxalate reference substance (A) and human urine sample (B)

图 2 草酸对照品 (A) 和人血浆 (B) 的HPLC图Fig. 2 HPLC of oxalate reference substance (A) and human plasma sample (B)

按样本处理法操作，对尿样本进行重复性试验，并经统计学处理。结果显示，样本中草酸测定精密度均较好，RSD为3.4%（n＝5）。

按样本处理法操作，对血浆样本进行重复性试验，并经统计学处理。结果显示，样本中草酸测定精密度均较好，RSD为4.1%（n＝5）。

按样本处理法操作，对同一尿样本进行重复性实验，并经统计学处理，其RSD为1.49%（n＝5）。

按样本处理法操作，对同一血浆样本进行重复性试验，并经统计学处理，其RSD为1.56%（n＝5）。

在0.29 mL尿液中（检测其质量浓度为7.201 mg/L）加入0.1 mL质量浓度为50、100、150 mg/L的对照品溶液，进样测得其质量浓度，计算其回收率，结果平均回收率为94.31%，RSD为1.22%。

在0.29 mL血浆中（检测其质量浓度为7.150 mg/L）加入0.1 mL质量浓度为50、100、150 mg/L的对照品溶液，进样测得其质量浓度，计算其回收率，结果平均回收率为94.89%，RSD为0.72%。

按样本处理法操作，分别在0、4、8、12、24、48 h测定同一份尿样。结果草酸质量浓度的RSD为4.9%，48 h内样本稳定。

按样本处理法操作，分别在0、4、8、12、24、48 h测定同一份血浆样本。结果草酸质量浓度的RSD为4.9%，48 h内样本稳定。

测得天津市第一中心医院PH男性患者接受肝肾联合移植术前后草酸的变化。结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 病人尿液中草酸的量 Table 1 Oxalate content in urine of patients 编号 年龄 尿草酸 / (mg∙L−1) 手术前24 h 治疗2个月后 治疗半年后 1 36 126.46 89.10 15.55 2 16 69.37 34.10 29.01 3 49 45.00 21.11 18.22 4 12 76.09 51.20 37.03 5 39 72.09 60.03 43.00 6 23 67.78 51.99 36.66

表 1 病人尿液中草酸的量 Table 1 Oxalate content in urine of patients

表 2(Table 2)

表 2 病人血中草酸的量 Table 2 Oxalate content in plasma of patients 编号 年龄 血草酸 / (mg∙L−1) 手术前 治疗2个月后 治疗4个月后 1 6 10.20 1.36 0.45 2 16 6.79 1.51 0.19 3 49 7.16 3.74 0.51 4 12 8.03 5.09 2.00 5 39 7.66 4.06 2.11 6 23 6.99 3.78 1.56

表 2 病人血中草酸的量 Table 2 Oxalate content in plasma of patients

PH是一种少见的常染色体隐性遗传病。由于PH患者肝特异性过氧化丙氨酸化一乙醛酸盐氨基转移酶（AGT），导致草酸产生过多并从尿液中排泄，反复发作的尿石症和肾钙质沉着是其特征。这些草酸盐沉积造成的终末期肾病唯有肾移植才是医治此病的根本；同时PH患者由于肝脏的代谢缺陷引起的草酸盐沉积，也必须实施肝移植手术^{[1, 2]}。本实验通过天津市第一中心医院收治6例患有PH的病人，应用RP-HPLC法监测患者实施肝肾联合移植术前后草酸质量浓度的变化。据文献报道^{[3, 4]}正常人体尿草酸值小于60 mg/L，正常人血中草酸浓度为1～10 μmol/L。上述实验结果显示，经过肝肾联合移植术，以及适当的口服用药等临床治疗，患者尿液与血液中的草酸浓度均趋于正常。表明患者移植术后肝肾功能的良好恢复状况，同时亦证明肝肾联合移植术对于PH患者的有效治疗。

本实验先采用一定浓度的磷酸二氢钾作为流动相，但结果不理想。杂峰较多，目标峰不明显，测定一个样本耗时较多（约45 min）。后采用甲醇-醋酸铵水溶液洗脱系统，以临苯二胺为衍生剂，与尿液与血液中草酸反应，生成具有强紫外吸收化合物2, 3-二羟基喹喔啉，此化合物在314 nm有强吸收峰。草酸的保留时间为7.2 min，此峰高与浓度具有良好的线性关系^[5]。

本实验方法简单快速，数据准确可靠，为临床通过检测草酸浓度来诊治疾病提供了良好的检测手段。