白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根，味苦、甘、涩，性微寒，主要含有芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷和苯甲酰羟基芍药苷等单萜苷类和苯甲酸、没食子酸、儿茶素、鞣质等成分；具有平肝止痛、养血调经、敛阴止汗等功效。其中芍药苷常作为芍药的指标成分，《中国药典》2010年版一部将其作为白芍药材质量主要控制指标之一^[1]。现代药理研究表明，白芍具有镇静、镇痛、抗炎、保肝、免疫调节和抑制血小板凝集等作用^{[2, 3]}。

发酵是传统炮制方法之一，应用历史悠久。发酵中药能达到减毒存效、增效、利于成分溶出及产生新的活性成分等新用途^[4]，但将白芍进行发酵，在传统炮制方法中并未有资料记载。目前已经有人利用双向发酵法，观察白芍被13种药用真菌发酵后芍药苷及芍药内酯苷的量变化^[5]，双向发酵后“药性菌质”中芍药苷及芍药内酯苷的量都明显降低了，但有未知的成分出现，提示双向发酵在发酵中药白芍中具有一定的研究意义。

本实验以白芍药材提取液对乳酸菌及酵母菌进行抑菌性检测，并优选其发酵工艺条件，目前尚未见相关报道；该实验能为白芍药材发酵提供实验依据。

岛津高效液相色谱仪，LC—20AT泵，SPD—M20检测器，岛津公司；LDZX—75KB立式高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；高速万能粉碎机，天津泰斯特FW100，南京以马内利仪器设备有限公司；BCD—215KALM冰箱，海尔集团；DHP—9082电热恒温培养箱，上海标仪仪器有限公司；THZ—C—1台式冷冻恒温振荡器，江苏太仓市实验设备厂。

乳酸菌为植物乳杆菌LP（批号BLCC2-0001）、地衣芽孢杆菌dy7（批号BLCC1-0014）、产软假丝酵母Cr（批号BLCC4-0021），均由山东宝来利来生物研究院菌种保藏中心提供。

白芍，3年生，采自于安徽省亳州市谯城区谯东镇余集，经中国中医科学院中药研究所炮制中心肖永庆研究员鉴定为毛茛科芍药属植物白芍Paeonia lactiflora Pall. 的根，并按药农方法经产地加工所制得去皮白芍药材和去皮硫磺熏蒸白芍药材。

芍药苷对照品，批号110736-201136；购于中国食品药品检定研究院，质量分数为96.0%；水为重蒸馏水，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

分别将硫磺熏蒸去皮白芍药材和未用硫磺熏蒸去皮白芍药材粉末加到一定量的水中，得到8%样品液，再按表 1配制后于121 ℃灭菌30 min，并将此液体作为发酵待测液。

表 1(Table 1)

表 1 白芍发酵配方表 Table 1 Prescription of PRA fermentation 发酵菌种 各菌种不同发酵配方 1 2 3 4 5 植物乳杆菌LP 乳酸菌培养基（MRS） 8%白芍（无硫） 8%白芍（硫熏） 8%白芍（无硫）＋MRS 8%白芍（硫熏）＋MRS 产软假丝酵母Cr 酵母菌培养基（YPD） 8%白芍（无硫） 8%白芍（硫熏） 8%白芍（无硫）＋YPD 8%白芍（硫熏）＋YPD

表 1 白芍发酵配方表 Table 1 Prescription of PRA fermentation

取植物乳杆菌LP、地衣芽孢杆菌dy7斜面培养物，分别接种于各菌种的液体培养基中，培养18～24 h。

表 2(Table 2)

表 2 乳酸菌发酵8%白芍不同时间活菌数结果 Table 2 Viable bacteria counts of 8% PRA samples fermented 发酵配方 乳酸菌活菌数 / (CFU∙mL−1) 24 h 36 h 48 h 1 1.5×109 1.2×109 2.5×108 2 4.0×108 6.7×108 3.7×108 3 3.8×108 4.5×108 3.6×108 4 2.2×109 1.8×109 4.1×108 5 2.0×109 1.6×109 3.8×108

表 2 乳酸菌发酵8%白芍不同时间活菌数结果 Table 2 Viable bacteria counts of 8% PRA samples fermented

测定各菌种发酵8%白芍添加各菌基础培养基的24、36、48 h活菌数，以活菌数较高点为发酵终点。

(1)乳酸菌发酵活菌数检测^[6]：以乳酸菌2%接种量添加到表 1各发酵配方中，参照“GB/T 13093-2006饲料中细菌总数的测定”方法，测定各乳酸菌发酵24、36、48 h的活菌数，结果见表 2。

由表 2结果可知，各白芍样品经乳酸菌发酵24 h即达到较高活菌数。无硫白芍样品组和硫熏白芍样品＋培养基组在24～36 h乳酸菌活菌数有明显增加；但在48 h反而有所下降；且白芍（无硫或硫熏）＋培养基组较白芍（无硫或硫熏）组活菌数高，说明在24～48 h进行发酵，加入培养基更有利于乳酸菌的生长，发酵48 h后各组活菌数差异不显著。

(2)酵母菌发酵白芍活菌数测定^[6]：按上述方法，测定各酵母菌发酵24、36、48 h的活菌数，结果见表 3。由表 3可知，发酵时间在24～36 h，与酵母菌基础培养基组活菌数相比，各白芍组酵母菌活菌数均高于酵母基础培养基组，说明白芍对酵母菌的发酵有促进作用；加入培养基各组活菌数均高于相应不加培养基活菌数；且各组活菌数有随时间变化呈上升的趋势；但发酵48 h后，活菌数变化不明显，反而呈下降趋势。

表 3(Table 3)

表 3 酵母菌发酵8%白芍不同时间活菌数结果 Table 3 Viable bacteria counts of 8% PRA samples fermented by microzyme during different time 发酵配方 酵母菌活菌数 / (CFU∙mL−1) 24 h 36 h 48 h 1 6.0×107 6.1×107 5.7×107 2 1.9×108 7.7×108 1.8×108 3 1.3×108 7.0×108 1.2×108 4 2.2×108 8.0×108 2.0×108 5 1.6×108 7.3×108 1.5×108

表 3 酵母菌发酵8%白芍不同时间活菌数结果 Table 3 Viable bacteria counts of 8% PRA samples fermented by microzyme during different time

精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇制成含芍药苷64.6 μg/mL的溶液，即得。 2.2.2 供试品溶液的制备

按“2.1.1”项下方法，将乳酸菌、酵母菌的种子液分别按2%接种量接种到表 1各发酵配方中，发酵24、36、48 h后，分别放入真空冷冻干燥机中冻干48 h，得到发酵供试品。

分别取上述发酵供试品粉末0.1 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加入30 mL 50%乙醇，超声50 min（功率240 W，频率45 kHz），放冷，加50%乙醇定容至刻度，用0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

按《中国药典》2010年版附录IX H项下“烘干法”对“2.1.4”项下所制备的去皮白芍药材及去皮硫磺熏蒸白芍药材发酵供试品进行水分测定，结果见表 4和表 5。

表 4(Table 4)

表 4 白芍药材发酵供试品水分、芍药苷定量测定结果 (n= 3) Table 4 Contents of paeoniflorin and moisture in fermented PRA samples (n = 3) 编号 样品 水分 芍药苷 含水量 / % RSD / % 质量分数 / % RSD / % 1 乳酸菌8%白芍（无硫）24 h 4.948 4 1.41 3.149 8 0.04 2 乳酸菌8%白芍（无硫）36 h 4.341 3 1.51 3.194 1 0.03 3 乳酸菌8%白芍（无硫）48 h 6.913 4 1.58 3.091 9 0.15 4 乳酸菌8%白芍（无硫）＋培养基24 h 6.582 2 1.74 0.752 3 0.07 5 乳酸菌8%白芍（无硫）＋培养基36 h 6.837 3 1.29 0.754 6 0.20 6 乳酸菌8%白芍（无硫）＋培养基48 h 6.943 9 1.12 0.798 6 0.21 7 酵母菌8%白芍（无硫）48 h 4.323 3 1.78 3.526 7 0.08 8 酵母菌8%白芍（无硫）36 h 4.686 8 1.45 3.575 8 0.12 9 酵母菌8%白芍（无硫）24 h 4.285 9 1.34 3.519 2 0.01 10 酵母菌8%白芍（无硫）＋培养基24 h 3.855 9 1.85 3.691 1 0.06 11 酵母菌8%白芍（无硫）＋培养基36 h 4.498 0 1.23 3.755 8 0.05 12 酵母菌8%白芍（无硫）＋培养基48 h 4.228 8 1.31 3.634 0 0.10

表 4 白芍药材发酵供试品水分、芍药苷定量测定结果 (n= 3) Table 4Contents of paeoniflorin and moisture in fermented PRA samples (n = 3)

表 5(Table 5)

表 5 硫熏白芍药材发酵供试品水分和芍药苷定量测定结果 Table 5 AContents of paeoniflorin and moisture in fermented PRA samples processed by sulfur fumigation 编号 样品 水分 芍药苷 含水量 / % RSD / % 质量分数 / % RSD / % 13 乳酸菌8%白芍（硫熏）24 h 4.383 3 1.38 3.095 3 0.61 14 乳酸菌8%白芍（硫熏）36 h 4.624 9 1.42 3.116 3 0.03 15 乳酸菌8%白芍（硫熏）48 h 4.257 0 1.23 3.020 9 0.11 16 乳酸菌8%白芍（硫熏）＋培养基24 h 7.414 5 1.63 0.727 9 0.26 17 乳酸菌8%白芍（硫熏）＋培养基36 h 7.402 0 1.42 0.707 1 0.03 18 乳酸菌8%白芍（硫熏）＋培养基48 h 4.852 7 1.63 0.689 5 0.23 19 酵母菌8%白芍（硫熏）24 h 4.041 7 1.38 2.698 8 0.11 20 酵母菌8%白芍（硫熏）36 h 3.776 7 1.52 2.651 5 0.12 21 酵母菌8%白芍（硫熏）48 h 4.520 2 1.63 2.696 1 0.01 22 酵母菌8%白芍（硫熏）＋培养基24 h 5.185 0 1.41 3.539 0 0.02 23 酵母菌8%白芍（硫熏）＋培养基36 h 4.320 4 1.89 3.574 1 0.02 24 酵母菌8%白芍（硫熏）＋培养基48 h 4.383 3 1.25 3.500 8 0.21

表 5 硫熏白芍药材发酵供试品水分和芍药苷定量测定结果 Table 5 Contents of paeoniflorin and moisture in fermented PRA samples processed by sulfur fumigation

按《中国药典》2010年版白芍中芍药苷定量测定项下方法测定。色谱条件：色谱柱为Kromasil 100-5 C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）；检测波长230 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL；体积流量1.0 mL/min。理论塔板数按芍药苷峰计算均不低于2 000。

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。以干燥品计算芍药苷的量，测定结果见表 4、5。

比较表 4、5结果可知，以乳酸菌发酵无硫白芍药材最佳工艺为2号，即乳酸菌8%白芍（无硫）36 h，其活菌数为6.7×10⁸ CFU/mL，芍药苷为3.194 1%；以乳酸菌发酵硫熏白芍药材，最佳工艺为14号，即乳酸菌8%白芍（硫熏）36 h，其芍药苷质量分数为3.116 3%；其活菌数为4.5×10⁸ CFU/mL；以酵母菌发酵无硫白芍药材，最佳工艺为11号，即酵母菌8%白芍（无硫）＋培养基36 h，其芍药苷质量分数为3.755 8%，活菌数为7.7×10⁸ CFU/mL；以酵母菌发酵硫熏白芍药材，最佳工艺为23号，即酵母菌8%白芍（硫熏）＋培养基36 h，其芍药苷质量分数为3.574 1%；活菌数为7.3×10⁸ CFU/mL。

表 2、3结果表明，在一定的时间内，发酵过程中加入培养基更有利于乳酸菌和酵母菌的生长，而且白芍药液对酵母菌的发酵有促进作用；但发酵供试品中硫熏白芍组中芍药苷质量分数与活菌数均低于相应无硫白芍组，表明白芍经硫磺熏蒸后，其成分有所改变，影响了酵母菌的繁殖。

上述结果表明，白芍以酵母菌发酵效果优于乳酸菌发酵效果，故发酵菌以酵母菌为佳；白芍和硫熏白芍其最佳发酵工艺是相同的。综合各发酵供试品中活菌数和芍药苷质量分数测定结果，以酵母菌进行发酵优于乳酸菌；白芍和硫熏白芍发酵最佳工艺为以酵母菌加入培养基发酵36 h。

按“2.1.1”项下发酵液的制备方法，以酵母菌8%白芍（无硫）加培养基发酵36 h工艺制备3批发酵供试品，测得其芍药苷平均质量分数为3.752 4%；平均活菌数为7.6×10⁸ CFU/mL；以酵母菌8%白芍（硫熏）加培养基发酵36 h工艺制备3批发酵供试品，测得其芍药苷平均质量分数为3.573 9%；平均活菌数为7.2×10⁸ CFU/mL；分别优于表中其他发酵供试品；证明工艺可行，结果见表 6。

表 6(Table 6)

表 6 工艺验证试验结果 Table 6 Results of technology verification 样品 芍药苷 乳酸菌 质量分数 / % RSD / % 活菌数 / (CFU∙mL−1) RSD / % 酵母菌8%白芍（无硫）＋培养基36 h 3.754 3 0.06 7.5×108 1.31 3.749 8 7.7×108 3.753 1 7.6×108 酵母菌8%白芍（硫熏）＋培养基36 h 3.574 8 0.10 7.2×108 0.80 3.569 8 7.3×108 3.577 1 7.2×108

表 6 工艺验证试验结果 Table 6 Results of technology verification

将白芍进行发酵，在传统炮制方法中并未有相关资料记载，且中药在发酵过程中，菌种的选择非常重要。目前已经有研究利用药用真菌发酵白芍，考察其双相发酵对白芍的影响；但将细菌乳酸菌、真菌酵母菌用于白芍进行发酵，并进行比较研究，这是目前未见报道的。本实验将白芍药材及硫熏白芍药材以乳酸菌、酵母菌进行发酵，通过比较不同发酵时间活菌数并综合发酵供试品中芍药苷定量测定结果，优选出以酵母菌发酵效果为佳。

实验结果表明，白芍药材及硫熏白芍药材最佳发酵工艺条件相同，其发酵最佳工艺为以酵母菌加入培养基发酵36 h。通过3批验证试验，证明发酵工艺可行。本实验为白芍发酵工艺提供了试验依据，具有一定的科研意义。