金线莲别名金线兰、金丝草，在民间以全草作为药用，为珍稀名贵中药材，其主要基原植物为福建金线莲Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. 和台湾金线莲A. formosanus Hayata ^[1-2]。其中，福建金线莲具备清热凉血、祛风利湿、除湿解毒等功效，具有较高的药用价值^[3]。同时由于生长习性独特、野生资源分布较少，再加上人为的过度采挖，造成其野生资源的日益匮乏和市场价格的居高不下。另外，由于形态特征近似，一些同属以及斑叶兰属和血叶兰属的其他种在市场上也称为金线莲，造成了金线莲种源混杂，影响了金线莲的药材品质。

金线莲规范化栽培是保护野生资源、缓解药材短缺的重要举措。筛选出农艺性状好、药效成分高的优良品种是规模化栽培的前提，而品种选育需要对种质资源遗传背景进行深入研究。因此，通过分子标记等技术手段了解种质资源的遗传信息是十分必要的。直接扩增片段长度多态性（direct amplification of length polymorphism，DALP）标记是基于PCR的一种检测DNA多态性的方法，具有信息量大、无需预知DNA序列信息，以及较高重复性和稳定性的优点^[4]，被用于物种分类、品种鉴定、居群遗传学研究等 ^{[5, 6, 7, 8]}，是研究植物遗传多样性常用的分子生物学技术。

由于目前关于福建金线莲的研究较多集中在生物学特性^{[9, 10, 11]}、组织培养^[12]、化学成分和药理作用等方面^[13]，与其遗传背景相关的研究较少，因此本研究采用DALP分子标记技术，以不同地理来源14个福建金线莲及4个近似种居群为样本，从分子水平了解野生福建金线莲资源的多样性和遗传差异，为其驯化栽培、保护和利用提供理论参考。 1 材料与仪器 1.1 材料

依据金线莲的地理分布特点，样品分别采集自云南、福建、海南等地（表 1），并由中国医学科学院药用植物研究所云南分所李海涛副研究员鉴定。每份材料选取6棵植株，每棵植株分别取1～2片幼嫩叶片，放于纸袋中，于-20 ℃保存。

表 1(Table 1)

表 1 试验材料及来源 Table 1 Samples and resources of A. roxburghii 编号 种名 采集地点 A1 滇南开唇兰 A. burmannicus 云南文山 A2 福建金线莲 A. roxburghii 云南景洪 A3 福建金线莲 福建永安 A4 线柱兰一种 Zeuxine sp. 海南海口 A5 福建金线莲 云南金平 A6 福建金线莲 云南金平 A7 福建金线莲 云南金平 A8 福建金线莲 云南蒙自 A9 福建金线莲 云南蒙自 A10 福建金线莲 云南蒙自 A11 福建金线莲 云南屏边 A12 福建金线莲 云南文山 A13 福建金线莲 云南屏边 A14 福建金线莲 云南屏边 A15 福建金线莲 云南文山 A16 台湾金线莲 A. formosanus 福建永安 A17 大花斑叶兰 Goodyera bilamellata 云南保山 A18 福建金线莲 越南河江

表 1 试验材料及来源 Table 1 Samples and resources of A. roxburghii

Eppendorf 5804R台式离心机，Eppendorf BioPhotometer Plus核酸蛋白测定仪，Biometra TProfessional PCR仪，Biorad PowerPac^TM基础电泳仪电源，Biorad Sub-Cell^® GT Cell电泳槽，UVI FireReader凝胶成像系统，ABI 3730XL DNA分析仪。 2 方法 2.1 总DNA的提取

每份样本分别采集6个单株上的新鲜叶片，叶片经液氮冷冻后研成细粉，用OMEGA E. Z. N. A. SP Plant DNA Kit进行DNA的提取，以50 μL Elution 缓冲液进行洗脱。通过1%琼脂糖电泳检测DNA的完整度，用核酸蛋白测定仪检测DNA的纯度和质量浓度，最后将DNA质量浓度调整为25 ng/μL。 2.2 DALP扩增及检测

参照已有文献中报道的扩增引物^{[14, 15, 16]}，筛选出6对引物进行PCR扩增（表 2）。PCR反应体系为20 μL，包括2 μL 10×PCR缓冲液，2 μL DNA模板（25 ng/μL），0.5 μL正/反向引物（1 mmol/L），5 μL dNTPs（1 mmol/L），1 μL DNA聚合酶（0.5 U/μL），灭菌双蒸水9 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s、52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共36个循环；72 ℃延伸5 min。通过毛细管电泳检测电泳结果，将PCR产物稀释30倍，在96孔板的各孔中分别加入9.05 μL 去离子甲酰胺、0.05 μL Genescan 1 200相对分子质量内标和1 μL稀释后的PCR产物，95 ℃变性5 min，4 ℃静置10 min，3 000 r/min离心1 min，于ABI 3730XL DNA分析仪上进行毛细管电泳。5 kV预电泳2 min，2 kV进样10 s，15 kV电泳40 min，最后用Data Collection软件收集原始数据。

表 2(Table 2)

表 2 DALP标记分析的引物序列 Table 2 DALP primer sequence 引物 编号 序列 (5’→3’) 正向引物 P232 GTTTTCCCAGTCACGACGAC P233 GTTTTCCCAGTCACGACACG P234 GTTTTCCCAGTCACGACCAG P235 GTTTTCCCAGTCACGACCAC P243 GTTTTCCCAGTCACGACTCGA P245 GTTTTCCCAGTCACGACACCCAC 反向引物 PR1 TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC

表 2 DALP标记分析的引物序列 Table 2DALP primer sequence

按扩增产物在相对迁移位置的有无，有赋以“1”，无赋以“0”，生成分子数据矩阵，应用POPGENE 1.32软件对18个居群进行遗传参数分析，计算观测等位基因数（N_a）、有效等位基因数（N_e）、Nei’s基因多样性（H）、Shannon信息指数（I）、遗传距离与遗传一致度等参数。

使用NTSYS 2.1软件对Nei’s遗传距离进行非加权配对算术平均法（UPGMA）聚类分析，构建各居群之间亲缘关系聚类图。 3 结果与分析 3.1 不同引物检测的位点数和多态性

筛选6对能产生清晰、稳定谱带的引物对全部108个样本进行扩增，共检测到355个位点，多态性比率为100%，片段大小在100～1 200 bp。其中14个福建金线莲居群的多态性位点为340个，多态性比率为95.77%。6对引物检测的位点从43到67个不等，平均每对引物能检测到59.2个位点。 3.2 遗传距离

根据扩增位点信息计算得出，18个居群样本的遗传距离介于0.024 3～0.146 2，18个居群中，种上水平遗传距离最大的是A4和A13，为0.146 2；遗传距离最小的是A14和A16，为0.054 8。种内遗传距离最大的是A2和A13，为0.094 1，遗传距离平均值最小的是A9和A10，为0.024 3，种内遗传距离平均值为0.059 0（表 3）。

表 3(Table 3)

表 3 18份样本的DALP标记扩增结果 Table 3 DALP amplification results of 18 populations 编号 多态性位点数 多态位点百分率 / % 居群内遗传距离 平均值 A1 39 10.99 0.019 9～0.046 1 0.034 3 A2 86 24.23 0.058 0～0.155 1 0.087 1 A3 81 22.82 0.058 0～0.122 7 0.085 3 A4 115 32.39 0.085 2～0.175 0 0.131 6 A5 107 30.14 0.070 0～0.148 5 0.104 6 A6 124 34.93 0.113 2～0.171 7 0.136 1 A7 143 40.28 0.125 9～0.202 2 0.167 0 A8 117 32.96 0.097 6～0.151 8 0.125 9 A9 138 38.87 0.119 5～0.205 7 0.154 8 A10 117 32.96 0.085 2～0.175 0 0.133 9 A11 131 36.90 0.091 4～0.181 8 0.135 4 A12 95 26.76 0.061 0～0.119 5 0.092 4 A13 81 22.82 0.064 0～0.113 2 0.087 1 A14 96 27.04 0.061 0～0.129 1 0.095 3 A15 111 31.27 0.094 5～0.132 3 0.114 0 A16 90 25.35 0.046 1～0.145 3 0.093 3 A17 104 29.30 0.914 0～0.165 0 0.126 0 A18 80 22.54 0.052 0～0.103 8 0.075 3

表 3 18份样本的DALP标记扩增结果 Table 3 DALP amplification results of 18 populations

14个福建金线莲居群间基因分化系数（G_st）值为0.423 0，表明有42.30%的遗传分化存在于不同福建金线莲居群之间，有57.70%的遗传分化存在于居群内；居群每代基因流（N_m）为0.681 9，表明不同福建金线莲居群之间存在的基因流较小。这说明不同产地金线莲居群之间存在较大的遗传分化，而且各居群间基因流动性较小。其中N_a介于1.191 5～1.374 6，平均1.273 4；N_e介于1.047 2～1.111 8，平均1.074 4；H介于0.036 7～0.082 2，平均0.056 2；I介于0.064 5～0.139 3，平均0.096 9（表 4）。结果显示不同地理来源福建金线莲居群内的遗传多样性水平较低。

表 4(Table 4)

表 4 18份样本的遗传多样性指数 Table 4 Genetic diversity indexes of 18 populations 编号 Na Ne H I A1 1.087 3 1.024 4 0.018 0 0.030 8 A2 1.202 8 1.059 9 0.044 1 0.074 9 A3 1.205 6 1.055 4 0.042 0 0.072 6 A4 1.301 4 1.103 7 0.071 3 0.117 7 A5 1.253 5 1.067 9 0.051 3 0.088 9 A6 1.321 1 1.087 8 0.066 0 0.113 8 A7 1.374 6 1.111 8 0.082 2 0.139 3 A8 1.301 4 1.081 5 0.061 8 0.106 8 A9 1.354 9 1.100 3 0.074 9 0.128 3 A10 1.312 7 1.087 3 0.065 6 0.112 6 A11 1.321 1 1.085 3 0.065 1 0.112 9 A12 1.242 3 1.056 1 0.044 3 0.079 0 A13 1.202 8 1.059 8 0.044 2 0.075 0 A14 1.239 4 1.060 5 0.046 5 0.081 4 A15 1.284 5 1.071 0 0.054 9 0.096 5 A16 1.219 7 1.064 6 0.047 3 0.080 5 A17 1.264 8 1.102 3 0.068 8 0.111 3 A18 1.191 5 1.047 2 0.036 7 0.064 5

表 4 18份样本的遗传多样性指数 Table 4 Genetic diversity indexes of 18 populations

UPMGA聚类分析可以看出（图 1），以遗传相似性系数0.08为界，可以将18份样本划分为2个部分：第1部分为福建金线莲，包括居群A2、A3、A5～A15、A18，共计14份，根据聚类结果可将其划分为3类，第1类包括福建永安居群A3、云南蒙自居群A8～A10、云南屏边居群A11、A13、A14、云南文山居群A12、A15，越南河江居群A18，其中亲缘关系较近的居群为云南蒙自居群A8～A10和云南屏边居群A11，云南文山居群A12和云南屏边居群A13，云南屏边居群A14、云南文山居群A15和越南河江居群A18；第2类包括云南景洪居群A2，云南金平居群A6、A7；第3类为云南金平居群A5。从采集样本的分布区域来看，第1类福建金线莲来源较广，包括福建永安，云南蒙自、屏边、文山，越南河江；第2、3类福建金线莲来源仅限于云南景洪和金平。第2部分为福建金线莲近似种，包括云南文山居群A1、海南海口居群A4、福建永安居群A16和云南保山居群A17，其中同属的A1和A16与福建金线莲的亲缘关系较近，非同属的A4和A17与福建金线莲亲缘关系较远。

图 1 基于DALP标记18份样本的UPMGA聚类图 Fig. 1 DALP cluster analysis of 18 populations by UPMGA

居群的遗传多样性丰富程度与其进化历程相关，是其适应环境和生存能力的体现。对遗传多样性的研究可以揭示居群的进化历程，为进一步分析其进化潜力和前景提供重要的资料，从而有助于探讨物种濒危的原因及过程。

从物种水平上看，14个福建金线莲居群总的多态位点百分率（PPB）为95.77%，多态性较高，但是从居群水平上看，各居群的PPB介于22.54%～40.28%，多态性较低。福建金线莲居群间G_st值为0.423 0，即居群间的遗传变异为57.70%，居群内的遗传变异为42.30%，说明福建金线莲的变异主要存在于居群间，而居群内的遗传分化相对较小。N_m值为0.681 9，说明居群间基因流较小，这种情况会加大居群之间的遗传分化。由于一方面福建金线莲多分布于海拔300～600 m的中低丘陵区，生长于气候凉爽、腐殖质丰富、水湿条件良好，荫蔽度60%～80%、空气相对湿度85%～95%的环境下^[17]，苛刻的生长条件造成福建金线莲居群在地理上呈不连续分布；另一方面，虽然福建金线莲在中国南方地区分布广泛，然而不少分布地区由于生境破坏、过度采挖等情况，造成金线莲的分布范围日益狭窄化、片段化。因此，由上两方面产生的选择压力可能是导致居群分化的主要因素。

由于野生福建金线莲资源短缺、价格较高，药材市场常出现以次充好的现象。另外，即使是相同的物种，由于分布地区、气候条件、栽培方式等因素不同，不同产地的福建金线莲在化学成分方面也存在一定的差异^[18]。因此，对其基原植物的鉴别也是十分必要的。顾慧芬等^[19]对金线莲进行了多态性分析，认为随机扩增多态性（RAPD）方法可以区分不同产地的金线莲；吴佳溶^[18]采用相关序列扩增多态性（SRAP）技术获得的聚类结果能对福建金线莲和台湾金线莲进行区分。张福生等^[20]对鉴定金线莲的ISSR技术进行了优化。DALP的UPGMA聚类结果显示，不同产地的各个金线莲居群之间存在一定的遗传差异，在种上水平差异更为明显。因此，虽然以上几种不同分子标记的原理不同，但其结果均可为金线莲药材分类鉴别研究提供一定的参考。同时DALP是以通用测序引物M13为核心序列的双引物扩增，可扩增得到5’和3’端的序列不同但都含有M13序列的DNA产物。由于本研究中PCR产物长度可达到1 200 bp左右，对于一些存在长度差异的序列可以省去克隆步骤直接通过M13引物进行扩增测序而进一步获得其序列信息。

福建金线莲作为珍稀濒危植物已经被列入《野生动植物濒危物种国际贸易公约》的保护范围，生境变迁和过度采收等因素使得其居群的个体数量锐减，这很可能导致其遗传多样性降低，从而削弱其长期生存和适应环境的能力。保护野生资源、推广人工栽培是福建金线莲可持续利用的必经之路。目前已有不少公司和个人对福建金线莲进行收购和种植，这对缓解野生资源的紧缺起到一定的积极作用。然而，对于栽培的福建金线莲药材尚缺乏相关的质量标准，而且产地、种源、栽培方式等因素都可能对福建金线莲药材的品质产生影响，因此了解种质资源遗传背景信息，有目的地进行杂交组合及对其杂交后代的选择，培育优良品种，规范化种植，是维系福建金线莲这一珍稀药材合理利用的重要举措。