橘核Citri Reticulatae Semen为芸香科植物桠柑Citrus reticulata Blanco cv. Ponkan及其栽培变种的干燥成熟种子；具有理气、散结、止痛的功效。临床用于疝气疼痛、睾丸肿痛、乳痈乳癖^[1]。橘核的主要化学成分为柠檬苦素类似物如柠檬苦素（limonin）、诺米林（nomilin）等^[2]，柠檬苦素类似物是以柠檬苦素的化学结构为基本单位的一系列化合物，是一类高度氧化的四环三萜类植物次生代谢产物，具有抗肿瘤、昆虫拒食、抗病毒、镇痛、抗炎、催眠等多种生物活性。可用于功能性食品添加剂、抗癌食品、杀虫剂、饲料添加剂等^[3]。主要分布于芸香科和楝科植物体内，特别在柑橘属中含量丰富^[4]，在柑橘属果实的不同部位中，又以种子中的量最高，其次是果皮，果肉中的量最低^{[5, 6]}。研究表明在柑橘生长和成熟的过程中，柠檬苦素A-环内酯在柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶（limonoid- UDP-glucosyl transferase gene，LGT）基因的催化下转变成了无苦味的柠檬苦素类似物^[7]。LGT基因是柠檬苦素类似物合成过程中重要的基因。

本研究设计特异性引物，从椪柑中成功克隆获得LGT基因、分析并表达了椪柑LGT基因。结果发现椪柑LGT基因在橘核中表达量最低，其次为橘皮，表达量最高为橘肉。旨在探索LGT基因表达量差异，为柠檬苦素类物质合成及调控机制研究提供基础。

椪柑于2013年12月采于四川省蒲江县，由成都中医药大学裴瑾教授鉴定为芸香科植物椪柑Citrus reticulata Blanco cv. Ponkan，果实洗净，经乙醇擦拭及DEPC水处理，将果皮、果肉、橘核分离后立即放入液氮中保存，带回实验室，于-80 ℃冰箱保存。用于RNA提取。

Trizol总RNA提取试剂（TIANGEN），2×Taq PCR MasterMix（TIANGEN），ddH₂O（TIANGEN），cDNA反转录试剂盒（TOYOBO），THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（TOYOBO），多功能DNA纯化回收试剂盒（BioTeke）。

使用Trizol总RNA提取试剂分别提取橘皮、橘肉以及橘核中总RNA。凝胶电泳检测为3条带的总RNA进行反转录，反转录反应按cDNA合成试剂盒说明书进行。

根据文献报道^[8]LGT基因，使用软件Primer Primer 5.0、在线软件http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer设计引物，见表 1。以cDNA为模板，使用2×Taq PCR MasterMix分别进行PCR扩增，扩增体系20 μL：2×Taq PCR MasterMix，10μL；正向引物，1 μL；反向引物，1 μL；cDNA模板，5 μL；dd H₂O 3 μL。考察扩增条件为94 ℃，3 min；30循环（94 ℃，30 s；55～65 ℃，30 s；72 ℃，1 min）；72 ℃，5 min。PCR结果凝胶电泳检测，多功能DNA纯化回收试剂盒（BioTeke）纯化回收PCR产物，由上海生工生物工程有限公司测序。

表 1(Table 1)

表 1 引物设计 Table 1 Primer design 编号 引物序列 (3’—5’) 引物1 正向：ATGGGAACTGAATCTCTTGTTCAT 反向：TCAATACTGTACACGTGTCCGTCG 引物2 正向：CGGGATCCATGGGAACTGAATCTCTTGTTCAT 反向：CGAGCTCTCAATACTGTACACGTGTCCGTCG 引物3 正向：GCTGCTTATTACCATCACTTTCACGG 反向：GAAAGGATAAGGAGTTGACGGATGC 引物4 正向：TGCTATGCTTTGGGTTCAATC 反向：CGTTGCCGTCTTCTCCACTA

表 1 引物设计 Table 1 Primer design

使用在线软件http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html，找出LGT基因的开放阅读框（open reading frame，ORF），并获得其编码蛋白质序列；使用在线软件http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，将结果与NCBI中已登录的类似物种进行对比分析；使用软件MEGA 5.1将结果相似性达90%以上的物种LGT构建进化树；使用在线软件http://web.expasy.org/protparam/，分析其编码蛋白质序列的一级结构。运用SOPMA软件http://npsa- pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma. html预测椪柑LGT蛋白的二级结构。使用SWISS-MODEL软件http://swiss model. exp-asy. org/workspace/对其三级结构进行分析。

查阅文献报道^[9]，得到LGT基因的real-time PCR引物序列和内参基因β-actin的RT-PCR引物序列，见表 2。扩增体系20 μL：Thunderbird SYBR qPCR Mix，10 μL；正向引物1 μL；反向引物1 μL；cDNA模板，5 μL；dd H₂O，3 μL。考察引物扩增曲线、熔解曲线及标准曲线，考察RT-PCR条件：95 ℃，2 min；40个循环（94 ℃，15 s；55～65 ℃，45 s；60 ℃，45 s）。65～95 ℃进行熔解曲线分析，每个温度以每步0.5 ℃上升。确定条件后测试果实不同部分LGT基因表达量和β-actin基因的表达量。数据通过Bio-Rad cycle IQ进行分析，用2^－△△Ct法获得LGT基因的相对表达量。

表 2(Table 2)

表 2 β-actin和LGT基因引物序列 Table 2 Primer sequences of β-actin and LGT genes 基因名称 引物序列 (3’—5’) β-actin 正向：CCAAGCAGCATGAAGATCAA 反向：ATCTGCTGGAAGGTGCTGAG LGT 正向：GCTGCTTATTACCATCACTTTCACGG 反向：GAAAGGATAAGGAGTTGACGGATGC

表 2 β-actin和LGT基因引物序列 Table 2 Primer sequences of β-actin and LGT genes

Trizol法提取所得RNA紫外分光光度法测定A₂₆₀和A₂₈₀，A₂₆₀/A₂₈₀为2.0，凝胶电泳检测可见清晰3条带，可用于后续实验，见图 1。

图 1 Trizol法提取RNA凝胶电泳图 Fig.1 Gel electrophoresis of RNA extracted by Trizol

引物2在扩增条件：94 ℃，3 min；30 循环（94 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，1 min）；72 ℃，5 min下，可以得到1 000 bp左右的产物，见图 2。测序结果为1 530 bp的序列。

图 2 PCR产物凝胶电泳图 Fig.2 Gel electrophoresis of PCR products

测序分析表明，椪柑LGT基因全长1 530 bp，包含一段1 509 bp的ORF，编码502个氨基酸组成的蛋白，见图 3。

图 3 椪柑LGT基因编码的氨基酸序列 Fig.3 Amino acid sequence encoded by LGT gene in C. reticulata

将该蛋白通过NCBI上的Blastp比对发现，该蛋白属于葡萄糖基转移酶基因家族。比对结果显示，椪柑LGT基因与100余种NCBI上登录的植物有相似性，其中与同科植物甜橙Citrus sinensis L.、阿尔及利亚橘C. clementina Hort. ex Tan、葡萄柚C. paradise Macf. 的相似性分别达100%、99%、98%。将相似性达90%以上的比对结果用MEGA5.1构建进化树，见图 4。

图 4 椪柑LGT基因与相似物种的系统进化树 Fig.4 Phylogenetic tree of LGT gene of C. reticulata and other related species

通过ProtParam预测LGT蛋白分子式为C₄₅₈₅H₇₆₄₂N₁₅₃₀O₁₉₃₂S₃₂₈，相对分子质量为125 629.8，理论等电点为4.99。对该氨基酸序列进行亲疏水性分析，结果见图 5，横坐标表示氨基酸残基的序号，纵坐标表示残基的疏水、亲水特性，正值为疏水，负值为亲水。椪柑LGT蛋白中疏水性最大值为2.111，最小值为-0.567，总平均疏水指数（GRAVY）为0.711，预测其为疏水性蛋白。SOPMA软件预测椪柑LGT蛋白的二级结构为α-螺旋占40.24%，β-转角占4.18%，无规则卷曲占41.04%，延伸链占14.54%，结果见图 6。SWISS-MODEL对其三级结构进行预测，结果见图 7。

图 5 LGT蛋白质疏水性分析 Fig.5 Analysis of hydrophobic LGT protein

图 6 LGT蛋白二级结构预测图 Fig.6 Two-dimensional structure prediction of LGT protein 蓝色-α-螺旋 红色-折叠 绿色-β-转角 紫色-卷曲 blue-α-helix red-turn green-β-extended strand purple-coil

图 7 LGT蛋白三级结构预测图 Fig.7 Three-dimensional model prediction of LGT protein

引物序列可用于RT-PCR，条件考察结果是LGT扩增条件：95 ℃，2 min；30 c循环（95 ℃，15 s；57 ℃，45 s；60 ℃，45 s），β-actin扩增条件为95 ℃，2 min；30 循环（95 ℃，15 s；57 ℃，45 s；60 ℃，45 s），65～95 ℃进行熔解曲线分析，每个温度以每步0.5 ℃上升。

选择β-actin为内参基因，每个样品做4个重复，用2^-ΔΔCt法对样本基因进行表达差异相对定量分析。在本研究中选择橘核的表达为校准样本，橘皮和橘肉为待测样本。根据所得结果橘肉中LGT基因表达量较高，约为橘核表达水平的1.477 5倍（图 8）。

图 8 LGT基因相对表达量 Fig.8 Relative expression histogram of LGT gene

研究克隆获得的椪柑LGT，序列全长为1 530 bp，具有1 509 bp的完整ORF，编码502个氨基酸。将该蛋白通过NCBI上的Blastp比对发现，该蛋白属于LGT家族。预测LGT蛋白分子式为C₄₅₈₅H₇₆₄₂N₁₅₃₀O₁₉₃₂S₃₂₈，相对分子质量为125 629.8，理论等电点为4.99。并对该基因进行了生物信息学分析，为椪柑LGT基因提供了更多更详尽的信息。

研究发现椪柑LGT基因表达存在一定的器官组织特异性，在橘肉中表达量最高，有研究表明柠檬苦素类物质在橘核中的量最高，其次是果皮，果肉中量最低^[5]。在今后研究中，可以同时结合化学成分研究，找出基因表达与化学成分的的关联性，为进一步研究该基因的功能及其在柠檬苦素类物质合成过程中的作用及其调控机制研究提供更多的信息。

开展柠檬苦素类物质代谢工程研究，进而利用细胞工程生产柠檬苦素类物质前景良好。深入探讨柠檬苦素类物质合成代谢的关键酶的作用及调控机制，期望以基因工程手段干预增加柠檬苦素类物质的量成为现实。为最终实验利用基因工程结合细胞工程生产柠檬苦素类物质生产奠定理论基础。