目前，肿瘤和神经退行性疾病的发病率在全球范围内呈增长趋势，已严重影响了人类的生命和生活质量。这两种疾病在病理机制上相互关联，单一靶点的化学药治疗顾此失彼，亟需开发具有多重功效的药物来解决这种问题。靛玉红是一种多靶点抑制剂，在中国古代用于治疗慢性粒细胞性白血病，现代药理学研究表明靛玉红具有神经保护作用。靛玉红是细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）和糖原合成酶激酶-3（GSK-3）的双重抑制剂，这两类酶是肿瘤和神经退行性疾病中的关键靶点，本文尝试从机制上探讨靛玉红的作用原理，以期更好地阐述靛玉红及其类似物的药理作用。

靛玉红为吲哚类化合物，存在于靛蓝、多种腹足纲软体动物、健康和患病人群的尿液，以及各种野生型或重组细菌中^[1]。历史上，靛玉红是中国著名传统药方当归龙荟丸的主要活性成分，用于治疗慢性粒细胞性白血病^{[2, 3]}。靛玉红及其类似物已被作为CDKs和GSK-3的抑制剂^{[4, 5, 6]}。该特性归因于靛玉红是CDKs和GSK-3的ATP竞争性蛋白激酶抑制剂^{[5, 7]}。此外，靛玉红及其类似物的分子靶标也包括芳香烃受体^[8]、C-Jun氨基末端激酶（JNK）^[9]和糖原磷酸化酶B^[10]。最近的研究表明GSK-3和CDKs在神经退行性疾病中也发挥极为重要的作用^[11]，腹腔注射靛玉红和靛玉红-3′-单肟（indirubin- 3′-monoxime）后，小鼠体内多巴胺神经元得到明显保护，这表明靛玉红及其类似物能很好地透过血脑屏障并保护神经元^{[12, 13, 14]}。目前，具有更好药理活性的靛玉红类似物也已经被合成，这些药物的溶解度较靛玉红有较大提高，具有更佳的细胞渗透性，更有利于组织和细胞内分布，并保持高效力和选择性，已经进行了多种药理作用的研究^{[1, 15, 16]}。综上所述，靛玉红及其类似物是一类有潜力的GSK-3和CDKs的高效抑制剂，具有双重治疗癌症和神经退行性疾病的前景。

蛋白质磷酸化是一个基本的翻译后修饰，调节细胞寿命（分化、分裂、增殖、凋亡）的各个方面，而异常磷酸化是许多疾病如神经退行性疾病、癌症和糖尿病的病因或后果^{[17, 18]}。磷酸化或去磷酸化会以多种方式影响蛋白质的功能，增强或抑制其活性，标记蛋白质准备降解，使蛋白质在亚细胞区间移动，或使之能够与其他蛋白质结合或离解。这种简便、灵活、可逆的翻译后修饰，随时可提供磷酸基团的ATP，使其可以参与调节许多生物学过程^[19]。CDKs负责一些细胞分裂蛋白质的磷酸化，因此是具有代表性的肿瘤潜在治疗靶标^[20]。GSK-3β的异常调节已经涉及多种人类疾病，包括癌症、非胰岛素依赖型的糖尿病、心血管疾病、一些神经退行性疾病和双相性精神障碍等^[21]。

靛玉红及其类似物是潜在的CDKs和GSK-3选择性抑制剂，通过与ATP结合的竞争作用，可用于治疗癌症和神经退行性疾病。靛玉红及其类似物可插入激酶的ATP结合口袋。不同结构的比较表明，靛玉红及其类似物结合在这种密集环境中会有一种非常相似的取向^[1]。靛玉红及其类似物不同的晶体结构有助于提高其对CDKs和GSK-3抑制效力和选择性^{[4, 22]}。C-6位取代对选择性至关重要，而C-3′位对结合亲和力非常重要。在靛玉红类似物的C-6位取代物中，溴取代对GSK-3的抑制活性最高，计算表明这主要是由于范德华力的作用。在靛玉红C-5位引入磺酸基团（如indirubin-5-sulfonic acid）可显著性增强对CDK1/cyclinB的抑制活性（IC₅₀＝5 nmol/L）^[4]；当磺酸基团被N, N-二甲基磺酰胺基团替换时，对CDK1和CDK2的抑制效力会显著升高。然而，该类化合物并不能充分进入肿瘤细胞，因此对肿瘤生长抑制能力较差。与靛玉红相比，在C-3′位上简单地引入肟基后，靛玉红-3'-单肟对各种CDKs的抑制活性增加了5～50倍^[15]。

在靛玉红类似物中，靛玉红-3′-单肟（IC₅₀＝22 nmol/L）和5-iodoindirubin-3′-monoxime（IC₅₀＝9 nmol/L）是2个最具潜力的GSK-3β抑制剂。靛玉红-3′-单肟的抑制效力可能是由于其能互补地结合到GSK-3β的非极性环中，但其对CDK2/cyclinA（IC₅₀＝440 nmol/L）的抑制作用显著下降。然而，5-磺酸取代基具有相反的性质，相比于对GSK-3β（IC₅₀＝280 nmol/L）的抑制活性，其对CDK2/ cyclinA的抑制活性（IC₅₀＝35 nmol/L）更强^[23]。

靛玉红及其类似物是CDKs（IC₅₀＝50～100 nmol/L）^[4]和GSK-3（IC₅₀＝5～50 nmol/L）的有效抑制剂^[12]。一些CDKs（如CDK1、CDK2、CDK4、CDK6）通过引起和协调细胞分裂周期，在抗癌中发挥至关重要的作用^{[24, 25]}。然而CDK5是中枢神经系统发育过程中神经细胞迁移的重要调节器^[26]。GSK-3参与多种细胞活动，并与几种疾病的发病机制相关，GSK-3抑制剂可被用来治疗与GSK-3紧密相关的疾病，如肿瘤和阿尔茨海默病。

最初，靛玉红治疗慢性粒细胞性白血病的主要机制被认为是与DNA结合^[27]。随后，靛玉红及其类似物被报道为CDKs的强效抑制剂，CDKs在细胞分裂周期和基因转录中发挥作用^[24]。在体外和体内实验中，靛玉红及其类似物作为GSK-3抑制剂能够减少胶质瘤细胞和神经胶质瘤起始细胞富集的神经球的入侵，并且β-连环蛋白信号在介导这些效应中起着重要作用^[28]。在MCF7细胞，7, 7′-diazaindirubin诱导的细胞周期停滞于G₁和G₂/M期，并且细胞凋亡^[29]。同样，靛玉红-3′-单肟和6-bromoindirubin- 3′-monoxime（6BIO）抑制细胞增殖，主要是通过使细胞停滞在细胞周期的G₂/M期^{[4, 18]}。此外，靛玉红-3′-单肟可逆地阻滞4种肿瘤细胞系（RT4、RT112、T24、TCCSUP）的生长。在RT4细胞中，靛玉红-3′-单肟几乎增加了4倍Survivin的表达，在RT112和T24细胞中也几乎翻倍；在TCCSUP细胞，Survivin表达在72 h孵化后升高超过7倍^[30]。6BIO在小鼠白血病模型中显示出治疗效果，并没有影响到放射后正常骨髓细胞的活力和造血功能的恢复^[31]。6BIO作为一个有潜力的抗肿瘤转移剂，大大减少了4T1小鼠乳腺癌模型中肺部转移的几率^[32]。AGM130（5′-OH-5-nitro-indirubin oxime）是一个潜在的替代药物，用于治疗对伊马替尼耐药的慢性粒细胞白血病，它在水中的溶解度远大于靛玉红。数据表明，AGM130有效地降低了慢性粒细胞白血病衍生的K562细胞的生存能力，也有效地降低了体外和体内的伊马替尼耐药的K562细胞的活性。另外，AGM130也可抑制磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（Rb），是CDKs的主要底物^[33]。

靛玉红类似物还通过其他一些相关途径抑制肿瘤。MLS-2384（一种新颖的6-bromoindirubin衍生物，在一个吲哚环的C-6位引入了溴基团，而在另一吲哚环上的C-3′位置引入亲水性基团）是JAK/Src激酶的双效抑制剂，抑制多种组织肿瘤细胞的生长，如前列腺、乳腺、皮肤、卵巢、肺和肝脏^[34]。indirubin- 3′-oxime-2, 3-dihydroxypropyl（E804）是一种靛玉红的衍生物，能够抑制Stat3和Stat5在慢性粒细胞白血病细胞中的活化^[35]。

靛玉红在由人脑皮层神经干细胞分化的神经元和神经胶质细胞的体外缺氧模型中具有神经保护作用^[36]。小胶质细胞在脑的免疫和炎症反应中起着重要作用。在病理条件下，小胶质细胞的活化有助于恢复脑的动态平衡。然而，慢性胶质细胞活化会通过释放多种促炎和神经毒性因子抑制神经元的存活。因此，小胶质细胞活化的调节剂被认为是潜在的候选药物，用于神经元退化的神经退行性疾病的治疗，如阿尔茨海默病和帕金森病。靛玉红-3′-单肟能有效抑制大鼠脑胶质细胞内脂多糖（LPS）诱导的NO释放。该化合物可降低LPS刺激产生的肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、前列腺素E₂和细胞内活性氧簇的量，也可有效地降低LPS引起的核转录因子-κB（NF-κB）活化。在脑部海马区切片组织培养中，靛玉红-3′-单肟可阻断内毒素诱导的海马区脑细胞死亡。这些结果表明，靛玉红-3′-单肟通过减少激活的小胶质细胞中各种神经毒性分子的产生而发挥神经保护作用^[37]。此外，在小脑颗粒神经元中，靛玉红-3′-单肟阻断了钾缺乏引起的C-Jun磷酸化，并且剂量依赖性地防止小脑颗粒神经元凋亡。然而，其他CDKs和GSK-3β抑制剂在体外和体内均不能减少C-Jun的磷酸化，这表明靛玉红-3′-单肟阻断C-Jun的磷酸化与其对CDKs和GSK-3β的抑制活性无关^[9]。靛玉红作为一种特异性GSK-3抑制剂，对小脑颗粒神经元的保护强于丙戊酸，并具有剂量依赖性。

在阿尔茨海默病患者脑中，微管相关蛋白tau会异常过度磷酸化、糖基化并聚集，降低tau蛋白水平是神经保护作用的机制之一。CDK5和GSK-3β可能通过促进tau蛋白的过度磷酸化而导致了阿尔茨海默病患者脑中神经原纤维变性^{[38, 39]}。6BIO可剂量依赖性地降低tau蛋白水平和tau蛋白的磷酸化。相反，CDK5的抑制剂Roscovitine降低了tau蛋白磷酸化，但不能改变tau蛋白水平^[40]。

在一项研究中，1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6- tetrahydropyridine（MPTP）通过减少GSK-3β的phospho-Ser9的量，以及增加底物phospho-Ser396的tau蛋白水平，可引起GSK-3β的快速激活。靛玉红-3′-单肟通过特异性抑制GSK-3β的活性，阻断了MPTP诱导的多巴胺神经元细胞凋亡，恢复了MPTP引起的纹状体多巴胺耗竭导致的行为障碍。这些结果表明，GSK-3β是MPTP神经毒性的关键中间体，抑制GSK-3β的活性可作为一种治疗帕金森病的新方法^[13]。在MPTP和KA（kainic acid）诱导的小鼠神经毒性实验中，3种靛玉红类似物6BIO、5- bromoindirubin-3′-monoxime（5BIO）和5-amino-6- bromoindirubin（5A6BI）减少了MPTP处理的小鼠中纹状体五羟色胺的产生量，并对KA诱导的纹状体损伤具有神经保护作用^[11]。

构效关系研究表明，靛玉红类似物结合GSK-3β的ATP口袋的方式与它们结合CDKs的方式相似，其中的细节已经由晶体学分析阐明。因此，大部分已知的CDKs抑制剂同时是GSK-3β的强效抑制剂^[12]。此外，GSK-3β和CDK5可一起作用于阿尔茨海默病中的成对螺旋丝（PHF，由微管结合蛋白tau的异常过度磷酸化引起）^[41]。某些靛玉红类似物是强有力的CDKs和GSK-3抑制剂并可以有效对抗各种癌症^[42]。这些结果表明，GSK-3/ CDK5抑制剂作为潜在的药物可同时用于神经退行性疾病和癌症的治疗。

靛玉红及其类似物被确定为CDKs强效抑制剂，它们已被用来治疗各种癌症已有几千年的历史。CDK2和CDK5与癌症和神经元迁移或分化相关的疾病紧密相关，可针对这些激酶设计相关的选择性抑制剂。

CDK5是一个多功能蛋白激酶，控制多个神经元的活动，包括迁移、突触活动、神经元生存和死亡^[43]，参与哺乳动物中枢神经系统的正常发育。CDK5可被调节亚基p35或p39结合而活化，它的活性由p35的合成和降解之间的平衡控制^[44]。p25是p35的截短形式，积聚在阿尔茨海默病患者的大脑神经元中，这种积累伴随着CDK5激酶活性的增加。不同于p35，p5不容易降解，p25与CDK5结合而激活CDK5，改变其细胞定位，并改变其底物特异性。在体内，p25/CDK5复合物高度磷酸化tau蛋白，从而降低tau蛋白与微管相结合的能力。此外，在原代培养的神经元中，p25/CDK5复合物的表达破坏细胞骨架，诱导细胞形态变性和细胞凋亡。这些结果表明，裂解的p35连同p25的积累，可能参与了神经退行性疾病中细胞骨架异常和神经元死亡的发病机制^[45]。tau蛋白聚集是神经变性疾病的共同特征，tau蛋白的过磷酸化使神经原纤维缠结（NFT）构成成对PHF已被认为是这一过程中的根本致病机制^[46]。为了探讨CDK5在tau蛋白聚集和缠结形成中的作用，使转基因小鼠过度表达CDK5的激活因子p25，因此转基因小鼠突变体（P301L）可过度表达人类tau蛋白。在突变体中，tau蛋白过度磷酸化是在几个不同的位置，在脑干和大脑皮层中有显著聚集的tau蛋白，这也伴随着NFT数量的增加^[26]。靛玉红-3′-单肟可时间依赖性地抑制癌细胞生长，并且在细胞发育过程中有许多标志性凋亡特征^[47]。此外，靛玉红-3′-单肟具有针对人神经瘤细胞的抑制活性。在LA-N-1细胞中，靛玉红-3′-单肟也可增加CDKs p27Kip1的水平，并减少CDK2和cyclin E的水平，从而导致细胞周期阻滞于G₀/G₁期。靛玉红-3′-单肟还特异地降低线粒体调节因子雌激素相关受体（ERRγ）和过氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子1β（PGC-1β）的表达，因此可以减少线粒体质量，并通过降低线粒体膜电位和活性氧的水平改变线粒体功能^[48]。

GSK-3是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶，针对大量的细胞靶点，其涉及的几条通路与许多疾病的发病机制相关，这促使GSK-3特异性抑制剂的研究成为热点。许多GSK-3的选择性小分子抑制剂对神经退行性疾病和癌症具有治疗作用。靛玉红及其类似物作为高选择性的GSK-3抑制剂，具有很大的开发潜力，尤其是与老龄化相关的疾病。

GSK-3β在不同的癌症中起着不同的作用，即肿瘤抑制基因或致癌基因。GSK-3β的复杂功能源于其参与不同的生理过程，具有功能多样性。一方面，GSK-3β下调Wnt/β-catenin信号通路，使得GSK-3β可作为Wnt/β-catenin信号通路相关癌症的一个很好的靶标。据报道，异常的Wnt/β-catenin信号和过度活化β-连环蛋白涉及许多类型的癌症。由于GSK-3β是Wnt基因细胞信号转导的关键负性调节因子，因此，这时GSK-3β可看作肿瘤抑制基因^{[49, 50, 51, 52]}。在另一方面，GSK-3β通过NF-κB途径保持细胞的存活和增殖。一些GSK-3β的小分子抑制剂通过RNA干扰抑制GSK-3β，来降低胰腺癌细胞的增殖和存活^[53]。在结肠癌细胞系和大肠癌患者中，肿瘤细胞中的GSK-3β表达水平及其活性形式均高于正常细胞^[54]。因此，GSK-3β到底是“致癌基因”还是“抑癌基因”取决于肿瘤的类型和通路。

同时，GSK-3β已报道涉及许多神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病，其抑制剂可被用于治疗这些疾病^[55]。Wnt/β-catenin信号通路的许多成分都表达于发育和成熟的神经系统中。Wnt/β-catenin信号已被证明是调节细胞凋亡，并可能参与了导致衰老脑细胞死亡退化的过程^[56]。GSK-3的抑制会增强异位β-连环蛋白的稳态水平^[57]。靛玉红对人脑皮层神经干细胞的神经保护作用表明，GSK- 3β抑制剂/β-catenin稳定剂可能是神经保护和体内神经再生治疗中的有效药物^[36]。

阿尔茨海默病是一种与年龄相关的神经退行性疾病，是目前为止痴呆的最常见形式^[58]。阿尔茨海默病的神经病理学特征是大量的丝状tau蛋白病变和纤维状β淀粉样蛋白（Aβ）积聚^[59]。根据淀粉样蛋白假说，Aβ的积累是由淀粉样前体蛋白（APP）衍生的，其在大脑中主要导致阿尔茨海默病发病。其余的疾病过程，包括形成含有tau蛋白的NFT，是由Aβ的产生和清除率之间的不平衡造成的^[60]。突出的tau丝状包涵体和非Aβ沉积导致的脑退化也是神经变性蛋白病的标志，出现在帕金森病等神经疾病当中^[59]。在阿尔茨海默病患者的脑中，GSK-3β的水平和活性异常增加，并被证明这与发病机制和神经元死亡相关^[61]。GSK-3β的抑制剂阻断了Aβ的产生和积累，通过干扰APP在γ-分泌酶步骤导致其裂解^[62]。此外，GSK-3α和GSK-3β在阿尔茨海默病中tau蛋白对状螺旋丝的产生中起重要作用^[63]。因此，GSK-3β抑制剂可用于减少NFT的形成和Aβ的产生，并通过抑制APP和tau蛋白的异常磷酸化对阿尔茨海默病起治疗作用^[55]。GSK-3β和蛋白磷酸酶2A（PP2A）的改变参与阿尔茨海默病的tau蛋白异常磷酸化和聚集。2个新型的靛玉红衍生物6-bromoindirubin-3′-[O-(N, N-diethylcarbamyl)-oxime]（6-BIDECO）和6-bromoindirubin-3′-[O-(2-morpholin- 1-ylethyl)-oxime] hydrochloride（6-BIMYEO）在OKA（PP2A抑制剂）诱导的动物模型中，相比于其他tau蛋白激酶，表现出针对GSK-3β更高的选择性，即6-BIDECO对GSK-3β的IC₅₀为0.03 μmol/L，CDK1的IC₅₀＞10 μmol/L，CDK5的IC₅₀为10 μmol/L；6-BIMYEO对GSK-3β的IC₅₀为0.11 μmol/L，CDK1的IC₅₀为1.8 μmol/L，CDK5的IC₅₀为0.9 μmol/L。结果表明，6-BIDECO和6-BIMYEO在微摩尔浓度不会干扰细胞周期并没有神经毒性，并且强效逆转tau蛋白磷酸化和OKA诱导的细胞凋亡^[64]。此外，另一个靛玉红类似物6BIO相比于锂（一种传统的GSK-3β抑制剂）是一个选择性更高和有效的GSK-3β抑制剂（IC₅₀ 1.5 μmol/L）。Western印迹分析表明，6BIO剂量依赖性地降低tau蛋白的水平和tau蛋白的磷酸化水平^[40]。

靛玉红及其类似物是一个由天然和修饰合成的化合物家族，表现出显著的多重药效，可作为的CDKs和GSK-3的双重抑制剂。CDKs和GSK-3各自或共同参与到癌症和神经退行性疾病的发病机制中。随着越来越多的具有更好溶解性和高选择性化合物的合成，靛玉红及其类似物有望成为双重治疗癌症和神经退行性疾病的先导化合物。