2014, Vol. 45
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.16.019 |
2. 云南省农业科学院药用植物研究所, 云南 昆明 650223
2. Institute of Medicinal Plants, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650223, China
龙胆苦苷是滇龙胆Gentiana rigescens Frach. ex Hemsl.、龙胆G. scabraBge.、三花龙胆G. triflora Pall. 和条叶龙胆G. manshurica Kitag. 等龙胆科植物中的主要有效成分[1]。龙胆苦苷的生物合成主要来源于甲羟戊酸（MVA）途径和2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径。在MEP途径中，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR，EC 1.1.1.267）是限速酶[2]，它能够催化1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸（DXP）异构化并还原生成MEP，该反应需要Mg2+或Mn2+的参与。目前，DXR基因已从拟南芥、水稻、玉米、番茄、橡胶树、喜树和银杏等许多植物中分离[3]，而且橡胶树[4]、大豆[5]、节节麦、拟南芥等植物中存在2个或多个DXR基因。Rohdich等[6]将拟南芥AtDXR基因在大肠杆菌中表达，结果其纯化蛋白可催化DXP形成MEP。DXR基因的表达受光、茉莉酸甲酯、机械损伤、真菌诱导子和植物根共生菌等的调控[3, 7, 8, 9]。在薄荷中过表达DXR基因，能够使薄荷精油产量提高50%[10]。在长春花Catharanthus roseus (Linn.) G. Don中，CrDXR基因表达量与单萜吲哚生物碱的累积呈正相关[11]。过表达DXR基因刺激MEP途径衍生的类异戊二烯精油[9]和转基因拟南芥中紫杉烯[12]的合成，而减少DXR基因表达则导致彩斑现象、色素减少和叶绿体发育停滞。在烟草叶绿体中过表达NtDXR基因，导致叶绿素a、β-胡萝卜素、叶黄素、百合黄素、玉米黄素和谷固醇等各种类异戊二烯萜类量增加[13]。在马达加斯加长春花Madagascar periwinkle Herb中，异恶草酮（clomazone）和膦胺霉素（fosmidomycin）对DXR蛋白的表达影响却很小[14]。因此，植物DXR蛋白在萜类合成和代谢中起着重要作用。
滇龙胆为传统中药材龙胆的主要植物来源之一[15]。目前，国内外对龙胆的研究主要集中在种子萌发[16, 17]、DNA条码[18, 19]、转录因子功能[20, 21]、育种等方面，而对滇龙胆GrDXR基因克隆和功能分析尚未有报道。本研究根据滇龙胆转录组中GrDXR基因序列，设计特异性引物，通过RT-PCR技术成功从滇龙胆幼叶中扩增到GrDXR基因，进行序列分析和原核表达。结果表明pGEX-4T-GrDXR工程菌在37 ℃、终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导下成功表达出目的蛋白。本研究为滇龙胆GrDXR蛋白的功能研究及通过在龙胆中过表达GrDXR基因提高龙胆苦苷量的研究奠定基础。
1 材料和试剂 1.1 材料滇龙胆Gentiana rigescens Frach. ex Hemsl. 植株栽培于玉溪师范学院资源环境学院分子生物学实验室。实验材料为滇龙胆无菌苗的幼叶。大肠杆菌DH5α和Rosetta（DE3）菌种购买于北京全氏金公司。
1.2 试剂多糖植物组织提取试剂RNAiso、反转录试剂盒、TA克隆试剂盒、限制性内切酶、IPTG、X-gal等均购自于宝生物工程（大连）有限公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；原核表达载体pGEX-4T-1由玉溪师范学院分子生物学实验室保存；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
2 方法 2.1 叶片总RNA提取、GrDXR全长cDNA的克隆和测序按照多糖植物组织提取试剂RNAiso说明书提取滇龙胆幼叶的总RNA；按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA。根据原核表达载体pGEX-4T-1多克隆酶切位点和转录组中滇龙胆GrDXR基因序列，设计一对特异引物GrDXR BamHI-F：GGATCCATGG-CTTTGAATTTGCTCTCC，GrDXR XhoI-R：CTCG-AGTCACACTAAAGCAGGGCTCT。以cDNA为模板进行PCR扩增，反应条件：94 ℃、3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃延伸7 min。GrDXR基因PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，割胶后，使用胶回收试剂盒按照说明书对目的片段进行回收，将其连接到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于添加100 mg/L氨苄青霉素＋IPTG＋X-gal的LB固体平板上，37 ℃培养13 h后挑取白斑，37 ℃、250 r/min摇床培养后提取质粒，经酶切鉴定正确后进行测序，获得重组质粒pMD19-GrDXR。
2.2 GrDXR基因的原核表达载体构建对质粒pGEX-4T-1和pMD19-GrDXR分别进行BamHI和XhoI双酶切，回收载体片段和目的基因，按物质的量比1∶4进行过夜连接，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于添加100 mg/L氨苄青霉素的LB固体平板，12 h后挑取克隆摇菌后提质粒，经酶切检测正确后，获得表达载体pGEX-4T-1-GrDXR。
2.3 GrDXR基因的生物信息学分析使用NCBI网站上的BLAST程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）进行序列比对，应用Genetyx进行翻译，并预测蛋白质相对分子质量和等电点（PI）等，使用DNAMAN 7进行多序列比对；使用Clustal X2.1进行比对，然后使用MEGA6.0软件内置的NJ法构建系统进化树，设置Bootstrap＝1 000；利用在线数据库（http://molbiol. edu.ru/eng/scripts/01_11.html）进行稀有密码子分析。使用ChloroP服务器v1.1（http://www.cbs.dtu.dk/ services/ChloroP）进行叶绿体转运肽预测；使用Interpro软件（http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html）进行保守结构域预测；使用ProtScalee软件进行疏水性分析（http://web.expasy.org/protscale）；使用Predic-tProtein（https://www.predictprotein.org）对二级结构预测，使用SWISS-MODEL服务器（http://swiss-model.expasy.org/workspace）对三级结构预测；利用Expasy中的TMHMM工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）预测GrDXR蛋白的跨膜螺旋区；利用在线工具WOLF PSORT（http://www.wolfpsort.org）预测GrDXR的亚细胞定位情况。
2.4 重组质粒pGEX-4T-1-GrDXR在大肠杆菌中的表达利用热激法将重组质粒pGEX-4T-1-GrDXR转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞，挑取单菌落接种于3 mL含100 mg/L氨苄青霉素LB液体培养基中，37 ℃、250 r/min培养12 h。然后以1∶100比例转接到无抗生素的LB液体培养基中，37 ℃、250 r/min培养3 h至A600≈0.8，在37 ℃、终浓度为1 mmol/L IPTG诱导下进行表达，同时以相同条件的pGEX-4T-1转化菌作为对照。分别诱导0、2、4、6 h后收集菌液2 mL。4 ℃、8 000 r/min离心1 min，弃上清，加入100 μL ddH2O、25 μL的5×SDS-PAGE上样缓冲液，震荡悬菌，沸水煮5 min。4 ℃、13 000 r/min离心5 min。取20 μL上清上样，进行SDS-PAGE（5%浓缩胶和10%分离胶）电泳检测。
3 结果与分析 3.1 滇龙胆GrDXR cDNA序列的克隆以滇龙胆幼叶cDNA为模板，扩增出1 500 bp左右的片段（图 1）。通过TA克隆获得重组质粒pMD19-GrDXR，酶切检测正确后进行测序，结果表明所扩增序列与转录组测序序列一致。
 | 图 1 GrDXR基因的PCR结果Fig. 1 PCR result of GrDXR gene |
利用Genetyx软件对GrDXR的序列进行分析，结果显示GrDXR基因的开放阅读框（ORF）为1 425 bp，编码474个氨基酸，将该序列上传至GenBank数据库，获得登录号KF941189；Gentyx推测GrDXR蛋白相对分子质量为51 340，pI为5.60。
利用GeneBank数据库中的BLASTp程序对GrDXR的氨基酸进行同源性分析，结果表明滇龙胆GrDXR蛋白与萝芙木HvDXR蛋白和橡胶树HvDXR蛋白相似性最高（89.64%），与银杏GbDXR蛋白和紫杉TcDXR蛋白序列的相似性较低（75.85%）。
利用MEGA软件将GrDXR氨基酸序列与从NCBI中挑选的同源性较高的部分已知序列进行系统进化分析，结果表明滇龙胆与萝芙木、橡胶树和长春花亲缘关系较近，与银杏、紫杉和喜树等植物中的DXR亲缘关系较远（图 2）。
 | 图 2 GrDXR蛋白与其他植物DXR蛋白的系统发育分析Fig. 2 Phylogentic relationship of GrDXR protein and some other DXR proteins |
利用DNAMAN将GrDXR氨基酸序列与从NCBI中挑选的同源性较高的部分已知序列进行多序列比对分析，结果表明GrDXR蛋白与已知蛋白序列高度保守（图 3）。
 | 图 3 GrDXR与其他植物中DXR序列的比对结果Fig. 3 Multiple sequence alignment of GrDXR with DXR sequences in other plants |
通过使用ExPASy ProtParam tool进行分析，GrDXR蛋白相对分子质量为51 350，理论pI值为5.66，分子式为C2312H3682N606O687S12。半衰期为30 h，不稳定指数为36.78，属于稳定蛋白；脂肪指数为101.86，总平均疏水性（GRAVY）为0.013。蛋白质的疏水性通常依据蛋白的GRAVY值来预测，GRAVY值在2～−2，若为正值，则此蛋白为疏水蛋白，反之则为亲水性蛋白。因此，GrDXR为疏水蛋白（图 4）。GrDXR蛋白含有20种氨基酸，其中亮氨酸的量最高，为10.5%；其次是丙氨酸和丝氨酸，分别为9.5%和8.2%；色氨酸量最低，为1.3%。对GrDXR进行稀有密码子分析，结果表明GrDXR基因中稀有密码子占1.05%，无二联或三联稀有密码子连续出现的情况，因此可选用BL21或Rosetta（DE3）进行原核表达。
 | 图 4 GrDXR蛋白的疏水性分析Fig. 4 Hydrophobicity analysis of GrDXR protein |
利用SSpro方法对GrDXR进行二级结构分析。结果表明该蛋白二级结构中α-螺旋（H）占39.03%，β-折叠（E）占14.14%，无规则卷曲（C）占46.84%。利用Swiss-Model Workspace预测GrDXR蛋白的三级结构，从图中可以看到GrDXR的三级结构主要由α-螺旋结构和无规则卷曲组成，与二级结构预测结果一致；另外，其三级结构形成能够结合底物的凹形区域（图 5）。
 | 图 5 GrDXR的三级结构预测Fig. 5 Predicted three dimensional structure of GrDXR protein |
采用InterProScan在线工具预测GrDXR蛋白的保守结构域。结果表明GrDXR蛋白具有4个保守结构域（图 6），分别为NAD (P)-binding domain （IPR016040，71-225），1-deoxy-D-xylulose 5-phosphatereductoisomerase，N-terminal（IPR013-512，79-207），1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase，C-terminal（IPR013644，221-304）和DXP reductoisomeraseC-terminal domain（IPR026877，336-462）。利用ExPASy SignalP 4.0 Server分析GrDXR蛋白，未发现信号肽，表明该蛋白为非分泌型蛋白。利用Expasy 中的TMHMM工具预测GrDXR蛋白的跨膜螺旋区，结果表明GrDXR蛋白为非膜蛋白。利用在线工具WOLF PSORT预测GrDXR蛋白的亚细胞定位情况，结果显示该蛋白可能定位于叶绿体。使用ChloroP在线软件对叶绿体转运肽进行预测，结果表明GrDXR蛋白含有叶绿体转运肽，为第1～50个氨基酸。
 | 图 6 GrDXR蛋白保守结构域的预测Fig. 6 Prediction of conserved domains of GrDXR protein |
使用BamHI和 XhoI双酶切质粒pGEX-4T-1- GrDXR，可切出目的片段（图 7），表明GrDXR基因已成功插入载体pGEX-4T-1中。重组表达质粒 pGEX-4T-1-GrDXR测序结果表明，目的基因与原序列一致，且未出现碱基突变及移码现象。这些结果表明已获得正确的重组质粒pGEX-4T-1-GrDXR。
 | M-Marker 1-质粒pGEX-4T-1-GrDXR的BamHI和XhoI双酶切结果 M-Marker 1-digestion result of plasmid pGEX-4T-1-GrDXR by BamHI and XhoI图 7 质粒pGEX-4T-1-GrDXR酶切检测Fig. 7 Digestion of pGEX-4T-1-GrDXR plasmid |
将重组质粒pGEX-4T-1-GrDXR转化大肠杆菌Rosetta（DE3）后进行IPTG诱导表达。在37 ℃、IPTG终浓度为1 mmol/L下，分别诱导表达0、2、4、6 h后，提取总蛋白进行SDS-PAGE分析。结果表明，与对照相比，pGEX-4T-1-GrDXR工程菌经IPTG诱导后，在相对分子质量77 340（含GST蛋白）左右有1条蛋白条带，表明重组质粒pGEX-4T-1-GrDXR在大肠杆菌Rosetta（DE3）中诱导表达了GrDXR蛋白。当温度为37 ℃、诱导时间为6 h时，蛋白表达量最大（图 8），可直接用于下一步的蛋白纯化。
 | M-Marker 1～2-pGEX-4T-1转化菌诱导0和6 h的总蛋白 3～6-pGEX-4T-1-GrDXR工程菌诱导0、2、4和6 h的总蛋白 M-Marker 1—2-pGEX-4T-1 bacteria with 1 mmol/L of IPTG induction for 0 and 6 h 3—6-pGEX-4T-1-GrDXR bacteria induced for 0, 2, 4, and 6 h图 8 37 ℃下不同诱导时间对GrDXR蛋白表达量的影响Fig. 8 Effect of different inducing time on expression of GrDXR protein at 37 ℃ |
DXR是MEP途径的限速酶[2]，因此克隆和鉴定DXR基因功能对于MEP途径研究非常重要。一般地，在植物基因组中DXR基因仅有1个拷贝[5]。目前，在滇龙胆转录组中，仅检测到1个GrDXR基因。本研究从滇龙胆幼叶中成功扩增出GrDXR基因，序列分析结果表明GrDXR蛋白与萝芙木、橡胶树和长春花中的DXR蛋白亲缘关系最近，暗示着它们具有相同或相似的功能。DXR蛋白催化DXP的反应需要NADPH的存在[2]，因此NADPH结合结构域对DXR酶的活性至关重要。结构域预测结果表明，GrDXR在其N端具有NAD（P）结合结构域GSTGSIGT和LAAGSNV、中间具有LPADSEHSAI和NKGLEVIEAHY 2个底物结合结构域、DXR的N末端和C末端结构域，这与其他植物中的DXR高度同源[22]（图 7），进一步表明所克隆基因编码GrDXR蛋白。所有植物DXR成熟蛋白在N端都有1个富含脯氨酸的区域，而在原核生物中却没有[7]。在GrDXR蛋白N端56～64位存在富含脯氨酸的PPPAWPGRA结构域。叶绿体或质体转运肽存在于所有植物DXR蛋白中，能够介导酶进入存在MEP途径的质体中[23]。本研究中，预测到GrDXR蛋白中存在叶绿体转运肽，长度为50个氨基酸。酶基因的功能体现在蛋白质上，本研究构建了原核表达载体pGEX-4T-1-GrDXR，转入大肠杆菌Rosetta（DE3），并成功诱导表达出GrDXR蛋白。该研究为滇龙胆GrDXR蛋白结构和功能研究奠定基础，也为萜类代谢工程提供候选基因。
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