葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.) Ohwi的干燥根^[1]，分布于我国除新疆、西藏外的广大地区。异黄酮类化合物是葛根的主要活性成分，已有研究发现其具有抗糖尿病、调血脂、改善血液循环和增强免疫力等药理作用^[2]。3′-羟基葛根素（3′-hydroxy puerarin）是葛根异黄酮类化合物的重要组成成分，且在葛根中的量较高。然而，有关3′-羟基葛根素药理作用的研究报道较少。本研究旨在通过观察3′-羟基葛根素对前脂肪细胞3T3-L1增殖、分化以及胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞糖脂代谢的影响，研究3′-羟基葛根素的抗糖尿病作用；同时通过探讨3′-羟基葛根素对过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxysome proliferator- activated receptor gamma，PPARγ）和蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）活性的影响以及基因表达的变化，分析其作用的分子机制。

3T3-L1前脂肪细胞株购于中国医学科学院细胞中心。人肝癌细胞株HepG2由中国医学科学院医药生物技术研究所肿瘤室提供。

3′-羟基葛根素（质量分数≥97%，批号DP-0300）购自上海榕柏生物技术生物有限公司；马来酸罗格列酮（简称罗格列酮，批号YY10901）购自上海源叶生物科技有限公司；正钒酸钠购自阿拉丁公司；地塞米松（批号D1756）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（批号101188683）、胰岛素（批号15500）均购自Sigma公司；葡萄糖测定试剂盒购自上海荣盛生物药业有限公司；游离脂肪酸（FFA）测定试剂盒购自南京建成生物有限公司；MEM培养基购自Hyclone公司；pGL3-promotor-GAL4和pBIND-PPARγ-LBD两种质粒由中国医学科学院医药生物技术研究所构建得到；荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司；脂质体2000转染试剂购自Promega公司；逆转录酶qPCR RT 试剂盒购自日本Toyobo公司；荧光定量qPCR试剂盒购自美国BIO-RAD公司；PTP1B检测试剂盒购自ENZO公司。

NU—4750型CO₂恒温培养箱（美国Nuaire公司）；BR4i低温高速离心机（美国Thermo公司）；ELX800多功能酶标仪（美国Bio-Tek公司）；NANODROP2000RNA浓度测试仪（美国Thermo公司）；CFD—3120荧光实时定量PCR仪（美国BIO-RAD公司）。

3T3-L1前脂肪细胞培养于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM高糖培养液中，HepG2细胞培养于含10%胎牛血清的MEM培养液中，均置于37 ℃、湿度95%、5% CO₂的细胞培养箱内培养。当细胞贴壁长满后，用胰酶消化，按1∶4的比例传代，取对数生长期的细胞进行实验。

将3T3-Ll前脂肪细胞转入96孔板中，调整细胞密度为3×10³个/孔。设置空白对照组、溶媒对照组（0.1% DMSO）、3′-羟基葛根素（0.1、0.3、1.0、3.0、10.0 μmol/L）组、罗格列酮（10.0 μmol/L）组和正钒酸钠（10.0 μmol/L）组。3T3-L1细胞按照不同处理方法作用48 h后，每孔加入MTT 20 μL，孵育4 h后，吸出旧培养液，每孔加入150 μL DMSO，混匀后置酶标仪主波长为570 nm，副波长为630 nm处测量吸光度（A）值，计算增殖促进率。

增殖促进率＝ (A_实验－A_空白对照) / A_空白对照

3T3-L1前脂肪细胞生长至接触抑制，加入含有0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1 μmol/L地塞米松和10 mg/L胰岛素的高糖DMEM培养基诱导48 h后，换为含10 mg/L胰岛素的高糖DMEM培养基再培养48 h，随后换用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基继续培养，每隔2 d换液，诱导分化8～12 d后，90%以上呈脂肪细胞表型可用于实验。在诱导分化第6天加入不同浓度的药物干预，药物分组同“2.2”项，作用48 h后弃去培养液，PBS洗3次，10%多聚甲醛固定30 min，用灭菌水洗3次，加入油红O溶液染色30 min，灭菌水洗3次，显微镜下观察，异丙醇充分溶解染色脂肪细胞内的油红O，选择520 nm波长在酶标仪上测定A值，计算分化促进率。

分化促进率＝(A_实验－A_空白对照) / A_空白对照

取诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞，将其分为对照组和模型组，对照组给予普通高糖DMEM培养基，模型组给予含有1 μmol/L地塞米松的培养基，孵育96 h后取细胞上清液，用葡萄糖氧化酶（GOD-POD）法测定细胞上清液中葡萄糖的量以反映胰岛素抵抗的程度。确定造模成功后，再分为空白对照组、溶媒对照组、模型组、3′-羟基葛根素组、罗格列酮组和正钒酸钠组，其中模型组给予正常DMEM培养基培养，其余组的处理方式同“2.2”项。另外，上述各组再分别按照不加胰岛素处理和加1 nmol/L胰岛素处理。根据不同处理方法作用48 h后，取细胞上清液，分别采用GOD-POD法和比色法检测细胞上清液中葡萄糖和FFA的量，按公式分别计算葡萄糖消耗率和FFA抑制率。

葡萄糖消耗率＝(A_实验－A_空白对照) / A_空白对照

FFA抑制率＝(A_空白对照－A_实验) / A_空白对照

取诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞，按“2.4”项方法制备胰岛素抵抗模型，确定造模成功后，加入不同药物干预，设置6个不同处理组：空白对照组、模型组、溶媒对照组、3′-羟基葛根素（0.1、1.0、10.0 μmol/L）处理组、罗格列酮组和正钒酸钠组，根据不同处理方法作用48 h，收集药物处理后的细胞，用Trizol法提取细胞的总RNA溶于无RNase水中，紫外分光光度计测定A₂₆₀/A₂₈₀值（1.8～2.0）。RT-PCR仪进行逆转录构建cDNA模板，逆转录反应条件参照试剂盒说明。PPARγ上游引物5’-AGGCCGAGAAGGAGAAGCTGTTG-3’，下游引物5’-TGGCCACCTCTTTGCTCTGCTC-3’，PCR产物为276 bp；PTP1B上游引物5’-AGTACGACAG- TTGGAGT TGG-3’，下游引物5’-TCGGGTGGAAG- GTCTAGATC-3’，PCR产物为450 bp；β-actin上游引物5’-CCACTGCCGCATCCTCTTCCTC-3’，下游引物5’-TCCTGCTTGCTGATCCACATCT-3’，PCR产物为400 bp。实时荧光定量PCR仪扩增条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，61.3 ℃（PPARγ）或57 ℃（PTP1B）退火5 s，45个循环。以β-actin为管家基因，采用2^−ΔΔCt法计算基因表达的相对变化，其中，ΔΔCt＝(Ct_未知样品－Ct_{未知样品内参})－(Ct_基准样品－Ct_{基准样品内参})。

体外酶活性测定，采用PTP1B 检测试剂盒方法检测3′-羟基葛根素（0.1、1.0、10.0 μmol/L）对PTP1B酶活性的影响，根据试剂盒指示进行操作，其中IR5作为PTP1B的底物，PTP1B抑制剂舒拉明（Suramin）作为阳性对照物。同时观察正钒酸钠在此酶体系的抑制效果。

人肝癌细胞株HepG2细胞用MEM培养基（加入10% FBS）培养，消化计数后以2×10⁴个/孔接种于96孔板，培养24 h后，用脂多糖 2000试剂将重组质粒pGL3-promotor-GAL4和pBIND- PPARγ-LBD共转染入细胞中，转染6 h后加药，药物分组为溶媒对照组（含0.1% DMSO）、3′-羟基葛根素（0.1、1.0、10.0 μmol/L）处理组、罗格列酮（1.5 μmol/L）组。24 h后用荧光素酶检测试剂盒检测细胞中荧光酶的活性。计算待测样品对荧光素酶活性的改变率（改变率＝给药组荧光素酶活性/对照组荧光素酶活性）。

实验数据以±s表示。采用SPSS 19.0软件进行统计分析，多组比较采用方差分析（One-Way ANOVA），两组比较采用t检验。

与溶媒对照组比较，3′-羟基葛根素在浓度为1.0～10.0 μmol/L时显著促进3T3-L1前脂肪细胞的增殖和分化（P＜0.05、0.01），且具有浓度依赖性。阳性药罗格列酮能显著促进3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化（P＜0.01），而正钒酸钠则能明显促进3T3-L1前脂肪细胞增殖，但抑制其分化。结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 3′-羟基葛根素对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响 (±s ,n=6) Table 1 Effects of 3′-hydroxy puerarin on proliferation and differentiation of 3T3-L1 preadipocytes (±s ,n=6) 组别 C / (μmol∙L−1) 增殖促进率 / % 分化促进率 / % 溶媒对照 — 0.45±0.14 1.34±0.22 3′-羟基葛根素 0.1 3.23±0.50 7.13±0.52 0.3 8.56±0.82 9.15±0.92 1.0 11.22±0.66 12.26±1.01 3.0 14.32±0.71 16.91±0.68 10.0 24.28±0.94** 21.39±0.92** 罗格列酮 10.0 34.21±0.72** 31.46±0.93** 正钒酸钠 10.0 23.22±0.46** −12.14±0.69 与溶媒对照组比较：P＜0.05 **P＜0.01，下同 P < 0.05 **P < 0.01 vs solvent control group,same as below

表 1 3′-羟基葛根素对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响 (±s ,n=6) Table 1 Effects of 3′-hydroxy puerarin on proliferation and differentiation of 3T3-L1 preadipocytes (±s ,n=6)

与溶媒对照组比较，无论在基础状态还是胰岛素刺激状态，胰岛素抵抗脂肪细胞的葡萄糖消耗量均显著降低（P＜0.01），证明成功建立胰岛素抵抗模型。与模型组比较，3′-羟基葛根素在1.0～10.0 μmol/L时能显著增加胰岛素抵抗脂肪细胞的葡萄糖消耗量（P＜0.05、0.01）；罗格列酮和正钒酸钠均能显著促进胰岛素抵抗脂肪细胞的葡萄糖消耗量（P＜0.01），结果见表 2。

与模型组比较，3′-羟基葛根素在1.0～10.0 μmol/L时能显著减少胰岛素抵抗脂肪细胞FFA的产生（P＜0.05、0.01）；罗格列酮和正钒酸钠均显著抑制胰岛素抵抗脂肪细胞FFA产生（P＜0.01），结果见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 3′-羟基葛根素对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量和FFA生成量的影响(±s ,n=6) Table 2 Effects of 3′-hydroxy puerarin on glucose consumption and FFA production in insulin resistant 3T3-L1 adipocytes(±s ,n=6) 组别 C / (μmol∙L−1) 葡萄糖消耗率 / % FFA抑制率 / % 不含胰岛素 含胰岛素 溶媒对照 — 40.64±0.62 44.65±1.07 54.80±2.01 模型 — 1.32±0.12** 2.31±0.14** 3.24±0.81** 3′-羟基葛根素 0.1 7.81±0.38 10.35±0.63 5.44±0.38 0.3 10.48±0.62 16.36±0.43▲ 10.56±0.34 1.0 16.10±0.74▲ 20.17±1.15▲▲ 13.97±1.23▲ 3.0 18.35±0.59▲▲ 24.29±0.97▲▲ 15.64±1.02▲ 10.0 23.02±1.11▲▲ 26.31±1.30▲▲ 20.17±1.35▲▲ 罗格列酮 10.0 36.50±1.05▲▲ 42.13±0.84▲▲ 42.81±1.23▲▲ 正钒酸钠 10.0 26.13±0.67▲▲ 31.25±0.89▲▲ 39.65±1.34▲▲ 与模型组比较：▲P＜0.05 ▲▲P＜0.01，下同 ▲P < 0.05 ▲▲P < 0.01 vs model group,same as below

表 2 3′-羟基葛根素对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量和FFA生成量的影响(±s ,n=6) Table 2 Effects of 3′-hydroxy puerarin on glucose consumption and FFA production in insulin resistant 3T3-L1 adipocytes(±s ,n=6)

由表 3可知，与模型组比较，3′-羟基葛根素在0.1～10.0 μmol/L时能显著上调PPARγ的mRNA表达（P＜0.01），但对PTP1B基因的表达则无明显影响（P＞0.05）；罗格列酮的结果与3′-羟基葛根素一致。正钒酸钠结果则与3′-羟基葛根素相反，其显著下调PTP1B基因表达（P＜0.01），但对PPARγ基因表达无明显影响（P＞0.05）。

表 3(Table 3)

表 3 3′-羟基葛根素对胰岛素抵抗脂肪细胞PPARγ和PTP1B mRNA相对表达的影响(±s ,n=6) Table 3 Effects of 3′-hydroxy puerarin on relative mRNA expression of PPARγ and PTP1B of insulin resistant adipocytes(±s ,n=6) 组别 C / (μmol∙L−1) PPARγ PTP1B 溶媒对照 — 2.61±0.10▲▲ 0.40±0.01▲▲ 模型 — 1.00±0.05 1.00±0.04 3′-羟基葛根素 0.1 1.84±0.16▲▲ 1.17±0.10 1.0 2.36±0.11▲▲ 0.92±0.07 10.0 3.83±0.13▲▲ 1.03±0.18 罗格列酮 10.0 3.93±0.19▲▲ 0.92±0.12 正钒酸钠 10.0 0.83±0.07 0.21±0.06▲▲

表 3 3′-羟基葛根素对胰岛素抵抗脂肪细胞PPARγ和PTP1B mRNA相对表达的影响(±s ,n=6) Table 3 Effects of 3′-hydroxy puerarin on relative mRNA expression of PPARγ and PTP1B of insulin resistant adipocytes(±s ,n=6)

从表 4可知，与溶媒对照组比较，舒拉明在10.0 μmol/L时能显著抑制PTP1B活性，抑制率达64.63%，提示本实验酶反应体系建立成功。正钒酸钠是公认的PTP1B抑制剂，本实验发现其10.0 μmol/L时对PTP1B的抑制率为15.33%。3′-羟基葛根素却明显激活PTP1B活性（P＜0.01），即对PTP1B没有抑制作用。

表 4(Table 4)

表 4 3′-羟基葛根素对PTP1B酶活性的影响(±s ,n=9) Table 4 Effects of 3′-hydroxy puerarin on PTP1B enzymatic activity (±s ,n=9) 组别 C / (μmol∙L−1) PTP1B抑制率 / % 溶媒对照 — 1.52±0.32 3′-羟基葛根素 0.1 −18.96±0.03** 1.0 −18.48±0.05** 10.0 −15.07±0.01** 正钒酸钠 10.0 15.33±0.64** 舒拉明 10.0 64.63±0.17**

表 4 3′-羟基葛根素对PTP1B酶活性的影响(±s ,n=9) Table 4 Effects of 3′-hydroxy puerarin on PTP1B enzymatic activity (±s ,n=9)

从表 5可知，与溶媒对照组比较，罗格列酮能明显激活PPARγ（P＜0.01），其荧光强度增加了3.75倍。3′-羟基葛根素在0.1～10.0 μmol/L内对PPARγ具有显著的激动作用（P＜0.05、0.01），尤其是在10.0 μmol/L时荧光强度增加了1.49倍。

表 5(Table 5)

表 5 3′-羟基葛根素对细胞PPARγ活性的影响(±s ,n=9) Table 5 Effects of 3′-hydroxy puerarin on PPARγ activity (±s ,n=9) 组别 C / (μmol∙L−1) 上调倍数 / % 溶媒对照 — 1.00±0.00 3′-羟基葛根素 0.1 1.26±0.03 1.0 1.16±0.02 10.0 1.49±0.04** 罗格列酮 1.5 3.75±0.08**

表 5 3′-羟基葛根素对细胞PPARγ活性的影响(±s ,n=9) Table 5 Effects of 3′-hydroxy puerarin on PPARγ activity (±s ,n=9)

脂肪组织作为人体最大的能量储备系统，是胰岛素作用的重要靶点和糖脂代谢的主要场所^[3]。一旦脂肪细胞出现胰岛素抵抗，就会严重影响周围组织的糖脂代谢，使葡萄糖摄取减少，FFA产生增多。脂肪组织过度分泌的FFA及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、瘦素（leptin）、抵抗素（resistin）等脂肪因子，可以进一步影响其他组织的胰岛素敏感性，也对胰岛β细胞产生毒性，影响其胰岛素的合成和分泌，加重糖脂代谢的紊乱^[4]。本实验选用地塞米松诱导3T3-L1脂肪细胞建立胰岛素抵抗模型，发现3′-羟基葛根素能显著增加胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖消耗量和减少FFA的产生，提示3′-羟基葛根素对胰岛素抵抗具有明显的改善作用。

PPARγ是一种配体激活的转录因子^[5]。当被配体激活后，它可与维甲酸类受体（RXR）形成异源二聚体，再与反应元件（PPRE）结合，调控下游靶基因的转录活化，从而改善胰岛素敏感性^[6]。噻唑烷二酮类（TZD）药物如罗格列酮和吡格列酮等是目前以PPARγ为靶点的治疗2型糖尿病的代表药物。但是这些药物在临床应用上通常会带来体质量增加、浮肿、增加充血性心力衰竭的发生率等不良反应^[7,8]。因此，近年来治疗2型糖尿病的药物研究集中在寻求具有与TZD类药物有相似疗效但毒副作用更小的PPARγ配体上。本实验通过在HepG2细胞中转染质粒重组质粒pGL3-promotor-GAL4和pBIND-PPARγ-LBD观察3′-羟基葛根素对PPARγ活性的影响，结果发现罗格列酮能明显激活PPARγ，而3′-羟基葛根素对PPARγ也有明显的激活效应，揭示其可能是潜在的PPARγ配体化合物。

脂肪细胞分化是由分化转录因子调控的复杂过程。PPARγ作为脂肪分化过程中重要的调节因子，其激活能促进脂肪细胞分化^[9,10]，但这也正是TZD类药物在临床应用中使患者体质量增加的主要原因。在3T3-L1前脂肪细胞分化的过程中分别加入不同浓度的3′-羟基葛根素，结果显示了3′-羟基葛根素能促进脂肪细胞分化，且作用效果呈量效关系。但是，也发现3′-羟基葛根素促进脂肪细胞分化的能力明显弱于相同浓度的罗格列酮，提示其较TZD类药物可能会降低体质量增加的风险。

PTP1B一直被认为是胰岛素受体后信号转导的主要负性调控因子，近年来更是成为治疗肥胖、2型糖尿病等胰岛素抵抗相关疾病的新靶点^[11]。正钒酸钠是公认的PTP1B抑制剂，故本实验选择其作为阳性对照药之一，结果发现3′-羟基葛根素与正钒酸钠作用相反，对PTP1B活性以及基因表达无明显影响，但与罗格列酮相似，均能显著上调PPARγ基因表达，尤其是在浓度为10.0 μmol/L时提高的程度接近同浓度处理的罗格列酮，提示3′-羟基葛根素可能具有胰岛素增敏作用，且其增敏作用可能与PPARγ激活途径有关。