2014, Vol. 45
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.16.012 |
肉苁蓉为列当科肉苁蓉属多年生草本寄生植物，药用其根，始载于《神农本草经》，列为上品。性温，味甘、咸，归肾、大肠经，有滋肝养肾、益精血、润肠通便的功效，用于治疗肾阳不足、精血亏虚、腰膝酸软、筋骨无力、肠燥便秘等症[1]。
《中国药典》2010年版收载的法定品种为荒漠肉苁蓉Cistanche deserticola Y. C. Ma和管花肉苁蓉C. tubulosa (Schenk) Wight[2]。两者化学成分相似，但寄生于红柳根上的管花肉苁蓉更容易进行人工栽培，已在新疆民丰县、于田县等地大面积种植，是目前市场流通量最大的肉苁蓉药材[3]。肉苁蓉中的苯乙醇苷类成分是其发挥补益作用的主要成分[4]，这类成分由苯乙醇基和糖构成，结构中的多个糖链决定了这类成分具有较高的水溶性。除了补益作用，肉苁蓉苯乙醇苷类成分还具有肝脏保护、神经保护等多种活性[5,6,7]。因此，肉苁蓉苯乙醇苷类成分的提取纯化工艺研究，对于其药效物质基础及新产品开发研究都具有重要意义。
本研究以管花肉苁蓉中的主要苯乙醇苷类成分松果菊苷和麦角甾苷为考察指标，采用L9(34) 正交试验设计，对提取工艺进行优化；并考察7种大孔树脂对上述苯乙醇苷的吸附和解吸附性能，确定纯化肉苁蓉苯乙醇苷的最佳工艺。
1 仪器与材料Agilent 1100型高效液相色谱仪，含G1311A四元泵、G1315A二极管矩阵检测器。松果菊苷（批号A0282）、麦角甾苷对照品（批号A0280），质量分数均＞98%，成都普思生物科技有限公司；肉苁蓉药材购于新疆维吾尔自治区于田县，经成都中医药大学张艺研究员鉴定为列当科肉苁蓉属多年生草本寄生植物管花肉苁蓉Cistanche tubulosa (Schenk) Wight的干燥根；大孔吸附树脂HPD400、HPD450、HPD600、HPD750、HPD826、DM130、ADS-17，沧州宝恩吸附材料科技有限公司；乙腈，色谱纯，Honeywell公司；甲酸、乙醇，分析纯，成都科龙化工试剂厂。
2 方法与结果 2.1 松果菊苷和麦角甾苷测定方法的建立 2.1.1 色谱条件[8]Waters Symmetry Shield RP18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Symmetry Shield RP18（20 mm×3.9 mm，5 μm）Guard 2Pk保护柱；流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～10 min，17%乙腈；10～30 min，17%～50%乙腈；检测波长330 nm。在此色谱条件下待测组分可达到基线分离，理论塔板数以松果菊苷、麦角甾苷计算均大于5 000。
2.1.2 对照品溶液的制备取松果菊苷、麦角甾苷对照品适量，精密称定，加30%乙醇制成含松果菊苷1.995 mg/mL、麦角甾苷1.299 mg/mL的对照品储备液，精密量取该储备液稀释10倍，作为对照品溶液。
2.1.3 线性关系考察精密量取松果菊苷、麦角甾苷对照品储备液，稀释5、10、50、100、500、1 000倍制得不同质量浓度的对照品溶液，精密吸取上述对照品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，测定峰面积，并以峰面积积分值为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X），进行回归分析。松果菊苷的回归方程：Y＝18 182 X－69.895，r＝0.999 6，表明松果菊苷在1.995～399 μg线性关系良好；麦角甾苷的回归方程：Y＝18 035 X－9.949 3，r＝1.000 0，表明麦角甾苷在1.299～259.8 μg线性关系良好。
2.2 肉苁蓉药材定量测定按《中国药典》2010年版肉苁蓉项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项方法测定。结果按干燥品计算，本研究所用肉苁蓉药材中松果菊苷和麦角甾苷的质量分数分别为14.01%、3.18%。
2.3 苯乙醇苷的提取工艺研究 2.3.1 提取溶剂考察分别取肉苁蓉药材粗粉50 g，加10倍量的水及30%、50%、70%乙醇，70 ℃温浸2次，每次1 h，滤过，回收溶剂后，加水定容至250 mL。取1 mL，加30%乙醇定容至100 mL，滤过，测定松果菊苷和麦角甾苷；另取200 mL（相当于40 g药材），置蒸发皿中挥干溶剂后，计算出膏量。上述提取溶剂所得粗提物中松果菊苷的质量分数分别为19.96%、23.28%、31.98%、28.7 8%；麦角甾苷分别为2.89%、4.57%、6.64%、5.93%。结果表明50%乙醇对松果菊苷和麦角甾苷的提取率最高。
2.3.2 正交试验以溶剂用量（A，8、10、12倍量），提取次数（B，1、2、3次），提取时间（C，1.0、1.5、2.0 h）为因素，以松果菊苷、麦角甾苷质量分数为指标，进行L9(34) 正交试验。实验结果见表 1，方差分析见表 2、3。
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表 1 L9(34) 正交试验设计与结果 Table 1 Design and results of L9(34) orthogonal test |
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表 2 方差分析表 (松果菊苷) Table 2 Analysis of variance (echinacoside) |
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表 3 方差分析表 (麦角甾苷) Table 3 Analysis of variance (acteoside) |
由直观分析（松果菊苷Ks、Rs，麦角甾苷Km、Rm）和方差分析结果可知，各因素对提取效率的影响顺序为A＞B＞C，且A因素有显著性影响，因此最佳提取方案为A3B2C1，即肉苁蓉药材加12倍量50%乙醇，70 ℃温浸2次，温浸时间1 h。
2.4 验证试验按正交试验优选的提取工艺，平行试验3次。肉苁蓉粗提物中松果菊苷、麦角甾苷的平均质量分数分别为33.21%、7.55%，见表 4。
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表 4 提取工艺验证试验结果 Table 4 Results of verification experiment of extraction process |
（1）静态吸附考察：取肉苁蓉药材50 g，加12倍量50%乙醇，70 ℃温浸2次，每次1 h，滤过，回收溶剂后，加水定容至250 mL（相当于0.2 g生药/mL），作为供试原液。分别称取不同型号经过预处理的大孔树脂HPD-400、HPD-450、HPD-600、HPD-750、HPD-826、DM-130、ADS-17各5 g，置50 mL锥形瓶中，加30 mL供试原液，振荡吸附24 h，静置后取1 mL上清液，加30%乙醇定容至100 mL，测定。计算静态饱和吸附量［饱和吸附量＝(初始质量浓度－吸附后质量浓度)×吸附液体积/干树脂质量］，结果见表 5。
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表 5 不同型号树脂静态吸附、解吸性能比较 Table 5 Static adsorption and desorption capacity of different resins |
（2）静态解吸考察：取已吸附好的树脂，经100 mL水洗后，加入50%乙醇溶液250 mL，置恒温振荡器上振荡解吸，取上清液1 mL，加30%乙醇定容至10 mL，测定。计算解吸率（解吸率＝解吸液质量浓度×解吸液体积/饱和吸附量），结果见表 5。
由表 5可以看出，HPD-750和ADS-17 2种树脂对松果菊苷、麦角甾苷的吸附量高于其他型号树脂，并且HPD-750的解吸率高于ADS-17，因此选择HPD-750进行下一步考察。
2.5.2 上柱液质量浓度考察将提取后的药液分别浓缩成含生药0.1、0.2、0.4 g/mL的上柱液。分别取3份处理好的HPD-750树脂装柱，每份15 g，将上述不同质量浓度的药液上大孔树脂柱（上柱生药量相同），上样后依次用3 BV的水、以2 BV/h的体积流量洗脱除去杂质，再用50%乙醇洗脱6 BV，体积流量为2 BV/h。洗脱液浓缩至干，测定，计算质量分数。松果菊苷分别为59.11%、63.16%、61.79%，麦角甾苷分别为10.21%、12.73%、11.26%。因此，上柱液的浓度确定为生药0.2 g/mL。
2.5.3 泄露曲线的绘制取50 g（体积为100 mL）处理好的HPD-750树脂装柱，取肉苁蓉上柱液，以2 BV/h的体积流量通过树脂柱，进行动态吸附，每10毫升接1流分，每1流分中取1 mL，加30%乙醇定容至100 mL，测定，绘制泄露曲线，见图 1。由图 1可知，当上样体积在9号流分（即上样量为90 mL）时出现明显地泄露。因此，上样量确定为80 mL，即0.8 BV。
 | 图 1 泄露曲线 Fig. 1 Dynamic leakage curves |
取肉苁蓉上柱液80 mL，加入到装有50 g HPD-750树脂柱中，依次用3 BV的水及10%、30%、50%乙醇以2 BV/h的体积流量洗脱，洗脱液按每0.5 BV收集1份，每份中取1 mL，加30%乙醇定容至100 mL，测定结果见图 2。苯乙醇苷主要集中在30%乙醇洗脱液中，并且水洗脱液不会将苯乙醇苷洗脱下来。
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1～6-水洗脱液 7～12-10%乙醇洗脱液 13～18-30%乙醇洗脱液19～24-50%乙醇洗脱液 1—6-water eluent 7—12-10% ethanol eluent 13—18-30% ethanol eluent 19—24-50% ethanol eluent图 2 洗脱溶剂的考察 Fig. 2 Investigation of eluting solvents |
取肉苁蓉上柱液80 mL，加入到装有50 g HPD-750树脂柱中，依次用3 BV的水以2 BV/h的体积流量洗脱除去杂质，再用30%乙醇洗脱，洗脱液按每1 BV收集1份，每份中取1 mL，加30%乙醇定容至100 mL，测定结果见图 3。在洗至4 BV时，洗脱率达到90%以上。同时，考虑到生产成本等因素，洗脱溶剂的量确定为4 BV。
 | 图 3 洗脱溶剂用量的考察 Fig. 3 Investigation of eluting solvent volumes |
取肉苁蓉上柱液80 mL，加入到装有50 g HPD-750树脂柱中，树脂柱的径高比分别为1∶3、1∶6、1∶9、1∶12，分别用3 BV的水以2 BV/h的体积流量洗脱除去杂质，再用4 BV的30%乙醇洗脱，洗脱液减压蒸干后，测定质量分数。结果显示，不同径高比的大孔树脂纯化样品中松果菊苷分别为60.15%、62.46%、63.91%、63.96%；麦角甾苷分别为11.65%、12.06%、13.21%、13.25%。从提高纯化效率和节约成本的角度出发，将径高比确定为1∶9。
2.5.7 水洗量的考察取肉苁蓉上柱液80 mL，加入到装有50 g HPD-750树脂柱中，树脂柱的径高比为1∶9，分别用1、2、3、4 BV的水以2 BV/h的体积流量洗脱除去杂质，再用4 BV的30%乙醇洗脱，洗脱液减压蒸干后，测定质量分数。结果显示，4种样品质量分数相差不大，但用3、4 BV水洗脱后，30%乙醇洗脱液颜色较澄清，HPLC色谱图中杂质峰较少，从提高纯化效率的角度出发，选择用3 BV的水洗脱。
2.5.8 大孔树脂纯化工艺的确定肉苁蓉提取液浓度调整为0.2 g生药/mL，上样量为0.8 BV，大孔树脂柱的径高比为1∶9，先用3 BV的水除杂，再用4 BV的30%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩至干，即得肉苁蓉苯乙醇苷纯化物。
2.5.9 大孔树脂纯化工艺验证试验按上述确定的纯化工艺制备3批样品，分别测定纯化前（粗提物）、后（大孔树脂纯化物）松果菊苷和麦角甾苷的量，并计算出膏率和转移率。结果表明，经大孔树脂纯化后，松果菊苷和麦角甾苷的质量分数分别由粗提物中的33.21%、7.55%提高到66.14%、13.43%，纯化物中2种苯乙醇苷的质量分数＞75%，见表 6。
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表 6 大孔树脂纯化前后松果菊苷、麦角甾苷质量分数比较 Table 6 Comparison on contents of echinacoside and acteoside before and after purification by macroporous resin |
本研究采用正交设计试验优化管花肉苁蓉苯乙醇苷的提取工艺。考虑到苯乙醇苷类成分结构中既有亲脂性基团，又有多个亲水性的葡萄糖取代基。因此，在考察提取溶剂时比较了水以及低浓度乙醇的提取效果，实验结果也证实50%乙醇的提取效率最高。同样的，笔者在预试验时也发现中等极性的大孔树脂对苯乙醇苷的吸附和解吸附效果较好。因此，通过比较多种型号中等极性大孔树脂的吸附、解吸附效果，最终筛选出HPD-750型树脂。
在分析正交试验结果以及大孔树脂工艺参数时，本研究综合考虑了提取效率、提取成本、药材成本等多种因素，筛选出最合理、稳定可行的提取纯化工艺。本工艺能够使管花肉苁蓉提取物中的主要苯乙醇苷类成分松果菊苷和麦角甾苷的量明显增加，可用于指导工业化生产。
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